[发明专利]一种硼酸介导的聚合酶链反应检测DNA中5‑羟甲基胞嘧啶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，是一种非诊断目的的快速、准确、高效检测和定位特定基因/片段中5-羟甲基胞嘧啶的生化分析方法。

背景技术

5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine，5hmC)是继5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)之后发现的第六种碱基，已在多种哺乳动物组织和细胞中检出。与5mC相比，5hmC的含量更低(2009年，Heintz研究组利用薄层色谱和质谱等分析方法，在人、小鼠大脑以及胚胎干细胞中检测到5hmC，皮质和脑干区5hmC表达丰富，浦肯野细胞中5hmC的含量约占总核苷酸的0.6％，在颗粒细胞中约占0.2％；S.Kriaucionis，N.Heintz，Science，2009，324：929-930)，但5hmC也同样具有非常重要的生物学功能。

现有的研究已经表明5hmC和TETs参与了基因组重新编程、基因表达的转录调控，并在DNA去甲基化过程中发挥重要作用。2011年，研究发现TET蛋白可将5hmC转变成5-甲酰胞嘧啶(5-formylcytosine，5fC)和5-羧基胞嘧啶(5-carboxylcytosine，5caC)。此两种碱基修饰产物都可以在基因组DNA中检测到，并且5hmC、5fC和5caC的基因组含量与TET蛋白的表达量有关。5fC和5caC的发现提示了一种新的主动去甲基化通路(5mC→5hmC→5caC→C)，为研究DNA去甲基化作用及生理功能指明了方向。5mC首先氧化为5hmC，并进一步氧化为5fC和5caC(S.Ito，L.Shen，Q.Dai，S.C.Wu，L.B.Collins，J.A.Swenberg，C.He，Y.Zhang，Science，2011，333：1300-1303)。而5fC和5caC可被一种重要的胸腺嘧啶DNA糖基化酶(Thymine DNA Glycosylase，TDG)识别并切除，形成非碱基位点，最后通过碱基切除修复通路将非碱基位点修复为正常的胞嘧啶。令人感到意外的是，DNA修复通路不仅负责细胞内的DNA损伤的消除而且参与DNA主动去甲基化。再次证明了DNA修复的重要性(Y.F.He，B.Z.Li，Z.Li，P.Liu，Y.Wang，C.He，G.L.Xu，et al.，Science，2011，333：1303-1307)。另外，Xu研究组发现TETs蛋白家族中的TET3在卵细胞重新编程过程中也起到了重要作用(T.P.Gu，F.Guo，H.Yang，G.L.Xu，Nature，2011，477：606-U136)；目前，大量的研究显示5hmC是5mC在去甲基化过程中的一种重要的中间体，实际上，基因组中5hmC含量较低，与推断其是一种短暂产生的中间体是相一致的。另外，5hmC在基因调控元件区具有独特的分布特点，研究发现5hmC和5mC都高度富集于基因内部，尤其是外显子区，只有5hmC在转录起始位点、5’非编码区富集，在其他基因转录调控元件区如增强子、启动子区域等5hmC表达水平较5mC相对高。综上，5hmC的生物学功能还不是很明确，但是可以确定的是5hmC和TETs在全基因组的表观遗传重组和组织特异性基因表达的调控中起到了非常重要的作用。另外，5hmC可能与特定肿瘤的发生密切相关，有可能成为肿瘤早期诊断的生物标志物。

对5hmC生物学功能的研究离不开高灵敏度、高特异性、高通量的检测方法。相对于基因组中含量较高的5mC，5hmC含量较低，且两者结构相似，导致传统的用于5mC的检测方法不能应用于5hmC的检测分析。例如，经典的重亚硫酸盐测序法。基因组DNA经重亚硫酸盐处理后，未甲基化的胞嘧啶可通过脱氨基和脱磺酸基作用转化为尿嘧啶(U)，再经聚合酶链反应(PCR)扩增转变成胸腺嘧啶(T)，而5mC经处理后不能转化为胞嘧啶(C)，PCR扩增后仍为C，从而可将5mC与未修饰的C区分。但是，5hmC由于不能脱氨基而形成5-亚甲基磺酸胞嘧啶，在重亚硫酸盐测序中5hmC和5mC都不能脱氨基，从而PCR扩增后二者不能产生序列差异，即5mC和5hmC不能被区分。