[发明专利]一种硼酸介导的聚合酶链反应检测DNA中5‑羟甲基胞嘧啶的方法

权利要求书

1.一种非疾病诊断用途的基于硼酸或其衍生物介导的聚合酶链反应(PCR)检测DNA中5-羟甲基胞嘧啶的生化分析方法，其特征在于：DNA链中的5-羟甲基胞嘧啶可被葡萄糖基化修饰，其邻二醇可与硼酸或其衍生物发生共价作用，显著抑制含葡萄糖基化5-羟甲基胞嘧啶DNA片段的复制与扩增；若DNA链不含5-羟甲基胞嘧啶其复制与扩增则不受影响，通过扩增曲线Ct值的变化对5-羟甲基胞嘧啶进行定量检测。

2.基于权利要求1所述方法，其操作步骤包括：首先，利用葡萄糖基化反应，将DNA中5-羟甲基胞嘧啶转化成葡萄糖基化5-羟甲基胞嘧啶，从而与5-甲基胞嘧啶以及胞嘧啶相区分；其次，利用硼酸或其衍生物试剂和葡萄糖基邻位二醇之间的反应，引入阻碍DNA复制的基团，从而来抑制特定基因序列片段正常的聚合酶链反应，使反应产率降低；同时，在葡萄糖基化反应基础上，不添加硼酸或其衍生物试剂，则特定基因/片段是正常的聚合酶链反应，在基因水平实现对5-羟甲基胞嘧啶的选择性识别；最后，采用实时荧光定量聚合酶链反应检测硼酸或其衍生物试剂对DNA复制过程的影响，过扩增曲线Ct值的变化来对5-羟甲基胞嘧啶进行定量检测。

3.基于权利要求1所述的方法，硼酸或其衍生物试剂是指硼酸、苯硼酸、3-氯苯基硼酸、2-(2’-氯苄氧基)苯基硼酸、3-(单磺酰胺)苯硼酸或其他可与邻二醇作用的硼酸类衍生物试剂。

4.基于权利要求1所述的方法，其特征在于使用聚合酶链反应程序是：起始95℃预变性2分钟；循环程序：95℃变性15秒，57℃退火15秒，25℃延伸60秒，共40个循环。

5.基于权利要求1所述的方法，其特征在于可应用于各种非疾病诊断目的的生物、细胞、组织、各种核酸序列中5-羟甲基胞嘧啶的分析检测。