[发明专利]一种人血清蛋白质电泳后同位素稀释质谱定量方法

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质定量分析技术领域，涉及一种人血清蛋白质电泳后同位素稀释质谱定量方法，尤其涉及聚丙烯酰胺凝胶电泳-激光烧蚀进样的电感耦合等离子体质谱联用技术结合电泳后同位素稀释法(PAGE-LA-ID-ICP-MS)定量人血清蛋白质的方法。

背景技术

随着蛋白质组学的迅速发展，蛋白质定量分析技术领域成为各国研究的热点，保证蛋白质定量结果的准确可比性是目前研究的难点。传统的蛋白质定量方法常采用凝胶电泳分离样品中待测蛋白质后，对凝胶上蛋白质点进行酶解处理，然后用电喷雾电离质谱或基质辅助激光解吸质谱等有机质谱进行定性、定量分析。然而定量分析中有机质谱的信号响应与蛋白质含量关系复杂，不能直接进行定量。

激光烧蚀进样的电感耦合等离子体质谱联用技术(LA-ICP-MS)是近年来迅速发展起来的一种固体微区原位分析技术，不仅具有ICP-MS的检测限低、信号响应与分子环境无关等优点，而且可对固体样品直接进行分析，还能对生物组织及细胞中的元素分布进行成像。LA-ICP-MS与凝胶电泳联用，可对分离的蛋白质直接进行定量分析，无需酶解、衍生等处理。其中硫(S)由于在蛋白质中普遍存在、含量大、稳定性高，常被作为蛋白质定量分析的元素。但是ICP-MS测定硫容易受到同量异位素¹⁶O₂⁺、多原子离子¹⁴N¹⁸O⁺等多种离子的谱线干扰，目前基于硫来定量蛋白质的PAGE-LA-ICP-MS文献研究较少，且主要涉及标准蛋白。

同位素稀释法(ID)是国际公认的权威性化学计量方法，如果能将PAGE-LA-ICP-MS与ID结合，将为无机质谱定量蛋白质技术提供新的思路。目前，基于ID技术的PAGE-LA-ICP-MS蛋白质定量分析中，主要是特异性同位素稀释法(Species-specific isotope dilution)，制备的特异性金属蛋白同位素稀释剂直接加入到待测样品中，具有传统同位素稀释法的优点，但是可人工合成的稀释剂仅有转铁蛋白、超氧化物歧化酶、铜蓝蛋白、铁蛋白等有限的蛋白质，不能用于人血清中多种蛋白质同时定量。而非特异性同位素稀释法(Species-unspecific isotope dilution)，以某元素的简单离子作为同位素稀释剂，基本都有商品化的产品，但是主要应用在高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱(HPLC-ICP-MS)联用定量蛋白质中，在PAGE-LA-ICP-MS的应用很少，其中定量分析存在的两个主要技术难点是如何实现同位素稀释剂的加入、如何确定激光烧蚀气溶胶中样品与稀释剂的质量。因此，将非特异性同位素稀释法应用到PAGE-LA-ICP-MS，对人血清中含硫蛋白进行定量分析还未见报道。

发明内容

为解决现有技术中出现的问题，本发明提供了一种人血清蛋白质电泳后同位素稀释质谱定量方法，尤其涉及聚丙烯酰胺凝胶电泳-激光烧蚀进样的电感耦合等离子体质谱联用技术结合电泳后同位素稀释法(PAGE-LA-ID-ICP-MS)定量人血清蛋白质的方法。本发明克服了特异性稀释剂种类有限带来的只能对某些蛋白质定量的难题，可对大多数蛋白质进行定量分析，效果理想，具有良好的应用前景。

本发明的目的是提供一种人血清蛋白质电泳后同位素稀释质谱定量方法，包括：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离人血清中转铁蛋白、白蛋白；开发的“电泳后同位素稀释”方法向蛋白条带上加入富集同位素³⁴S稀释剂；LA-ICP-MS检测蛋白条带中³²S⁺/³⁴S⁺比值，对人血清中转铁蛋白、白蛋白进行定量分析。

本发明所述的方法，具体步骤包括：

(1)待测样品的前处理：包括人血清蛋白标准物质(CRM)的重构，标准转铁蛋白、白蛋白样品溶液的配制，及样品(CRM、标准转铁蛋白溶液、正常人血清样品)的Fe富集处理；

(2)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离待测样品：采用垂直板微型凝胶电泳系统对待测样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳使用溶液中不含蛋白质变性剂，待测样品不经变性处理。根据转铁蛋白、白蛋白标准品的电泳条带位置确定CRM、正常人血清中的转铁蛋白、白蛋白位置；