[发明专利]一种人血清蛋白质电泳后同位素稀释质谱定量方法

权利要求书

1.一种人血清蛋白质电泳后同位素稀释质谱定量方法，其特征在于所述方法包括：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离人血清中转铁蛋白、白蛋白；开发的“电泳后同位素稀释方法”向蛋白条带上加入富集同位素³⁴S稀释剂；LA-ICP-MS检测蛋白条带中³²S⁺/³⁴S⁺比值，对人血清中转铁蛋白、白蛋白进行定量分析。

2.如权利要求1所述的人血清蛋白质电泳后同位素稀释质谱定量方法，其特征在于所述方法包括：

(1)待测样品的前处理：包括人血清蛋白标准物质(CRM)的重构，标准转铁蛋白、白蛋白样品溶液的配制，及样品(CRM、标准转铁蛋白溶液、正常人血清样品)的Fe富集处理；

(2)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离待测样品：采用垂直板微型凝胶电泳系统对待测样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳使用溶液中不含蛋白质变性剂，待测样品不经变性处理。根据转铁蛋白、白蛋白标准品的电泳条带位置确定CRM、正常人血清中的转铁蛋白、白蛋白位置；

(3)电泳后同位素稀释：电泳、染色、脱色处理后，切取待测蛋白条带，浸泡在25～50μg/g的富集同位素³⁴S稀释剂中2～10min，取出转移到甘油中浸泡2～5min，再将凝胶转移到载玻片上，室温过夜干燥，待测备用；

(4)LA-ICP-MS检测：采用激光烧蚀仪LSX213，对待测蛋白条带进行脉冲激光烧蚀进样，产生的气溶胶直接输送到ICP炬管；ICP-MS采用Element2扇形磁场电感耦合等离子体质谱仪，对蛋白条带上的³²S⁺、³⁴S⁺信号进行检测，得到以烧蚀时间/s为横坐标，硫元素信号强度/cps为纵坐标的谱图；

(5)待测蛋白样品的定量计算：

以已知浓度的转铁蛋白、白蛋白标准品作为样品，根据同位素稀释法公式得出m_z/m_y值(激光烧蚀气溶胶中样品和稀释剂的质量比)，然后将转铁蛋白、白蛋白的m_z/m_y值分别应用到人血清中转铁蛋白、白蛋白的定量分析，结合LA-ICP-MS检测的相应蛋白中³²S⁺/³⁴S⁺比值，再次利用同位素稀释法公式计算得到人血清转铁蛋白、白蛋白中硫元素浓度，根据相应蛋白质中硫的化学计量比，即可计算出人血清中转铁蛋白、白蛋白的浓度。

3.根据权利要求2所述的人血清蛋白质电泳后同位素稀释质谱定量方法，其特征在于：所述步骤(4)中激光烧蚀仪LSX213的工作条件为：激光能量2.0～4.0mJ/脉冲，扫描频率10～20Hz，光斑尺寸100～200μm，扫描速度30～60μm/s，烧蚀方式：线扫描。

4.根据权利要求2所述的人血清蛋白质电泳后同位素稀释质谱定量方法，其特征在于：所述步骤(4)中电感耦合等离子体质谱仪Element2的分辨率为4000，消除同量异位素¹⁶O₂⁺、多原子离子¹⁴N¹⁸O⁺等对³²S⁺的谱线干扰；工作条件为：功率1100～1400W，样品气流速0.90～1.20L/min，辅助气流速1.00～1.40L/min，冷却气流速15～20L/min，扫描次数700×1。