[发明专利]一种酮还原酶突变体及其制备和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种酮还原酶突变体及其制备和应用。

背景技术

孟鲁司特(Montelukast)，商品名顺尔宁(Singulair)，化学名为[R-(E)]-1-[[[1-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-[2-(1-羟基-1甲基乙基)苯基]丙基]硫代]甲基]环丙基乙酸钠，是由默克公司研制开发的一种高选择性半胱氨酞白三烯(Cys-LT)受体拮抗剂，它能竞争性拮抗白三烯D₄与Cys-LT1受体的结合，是治疗阿司匹林过敏性哮喘和运动性哮喘的最优选择。孟鲁司特不仅可以改善哮喘患者的肺功能，而且在抗炎、免疫等诸多方面也有重要的应用价值，具有广阔的应用前景。(S,E)-甲基-2-[3-[3-(2-(7-氯喹啉基-2-基)乙烯基]苯基]-3-羟基丙基]苯甲酸叔丁酯(分子式C₂₈H₂₄NO₃Cl，分子量457.96，CAS号142569-69-5)，是合成孟鲁司特钠(顺耳宁Singulair)的关键中间体。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种催化活性高、对映选择性好的酮还原酶突变体基因，及其编码的酮还原酶突变体，含有该基因的重组表达载体、基因工程菌及其制备方法，以及该酮还原酶突变体在催化还原其他酮类底物中的应用。特别的，将该酮还原酶突变体用于不对称还原酮类化合物的生产中。

本发明提供一种酮还原酶突变体基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或者由SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个核苷酸且具有酮还原酶活性的由(1)衍生的基因。

本发明提供一种高活性的酮还原酶突变体，其是(1)由SEQ ID NO.2所示氨基酸序列组成的蛋白质；(2)或是由SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个氨基酸且具有酮还原酶活性的由(1)衍生的蛋白质。

本发明的另一目的在于提供一种包含所述的的酮还原酶突变体基因的重组表达载体。其可通过本领域常规方法将本发明的酮还原酶突变体基因的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。所述的载体可为本领域常规的各种载体，优选pUC19。

本发明的另一目的在于提供一种包含本发明的重组酮还原酶基因或其重组表达载体的基因工程菌，本发明优选大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)。将前述重组表达质粒转化至大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中，即可得到本发明优选的基因工程菌。

本发明的另一目的在于提供一种利用该基因工程菌制备酮还原酶突变体的方法，包括构建该基因工程菌；筛选得到该基因工程菌；发酵培养该基因工程菌；以及收集和制备酮还原酶突变体。

本发明的另一个目的在于将由基因工程菌生产出的酮还原酶突变体应用到不对称还原酮类化合物以制备光学活性手性醇。

根据本发明提供的该基因工程菌的应用，其中，底物的结构式为：

有益效果：

本发明通过化学、分子生物学、生物信息学及高通量筛选方法，开发了一个具有较高特异性(对映体过量值>99.9％)及较好催化活性的重组酮还原酶，并将其与甲酸脱氢酶(FDH)及NADH共同使用，用于不对称还原2-[3-[3-(2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-氧代丙基]苯甲酸甲酯以制备(S,E)-甲基-2-[3-[3-(2-(7-氯喹啉基-2-基)乙烯基]苯基]-3-羟基丙基]苯甲酸叔丁酯。甲酸/甲酸脱氢酶是成功的辅酶再生体系，此反应产生的副产物CO₂对任何酶的活性均没有影响，底物甲酸价格低廉，且很多酶对甲酸有很高的耐受性。本发明的反应条件温和：常温、常压、中性或接近中性pH，设备要求不高，投入资金相对较少，且反应转化率高、对映体选择性高。

附图说明

图1本发明酮还原酶突变体催化不对称还原酮类化合物以制备光学活性手性醇的反应原理图。

生物材料保藏信息

大肠杆菌BL21(DE3)KRED1306(Escherichia coli BL21(DE3)KRED1306)，已于2014年3月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC NO：M2014078。

具体实施方式