[发明专利]一种单克隆表面展示核酸适体快速筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种针对多种靶标的单克隆表面展示核酸适体快速筛选方法，属于核酸适体筛选技术开发领域。

背景技术

核酸适体作为一类新型的分析、诊断分子，自出现以来，受到科研工作者的广泛关注。因其优于传统蛋白单克隆抗体的诸多特性，核酸适体已成为新兴的研究领域，在科研、疾病诊断和治疗试剂等方面逐步取代传统的抗体类诊断和生物技术产品。（1.G.Mayer,The chemical biology of aptamers,Angew Chem Int Ed Engl[J].2009,48,2672-2689;2.M.Mascini,I.Palchetti,S.Tombelli,Nucleic acid and peptide aptamers:fundamentals and bioanalytical aspects,Angew Chem Int Ed Engl[J].2012,51,1316-1332.）核酸适体是指从人工合成的单链DNA/RNA文库中筛选得到的能够高特异性地和高亲和力地与靶标分子结合的单链寡核苷酸。核酸适体借助氢键、范德华力、疏水作用等分子间弱作用力形成特殊的三维结构，如发夹、假结、凸环、G-四聚体等，从而特异地识别靶物质甚至影响其生物活性。核酸适体本身特有的生化特性使其在生物医学应用领域具有诸多优势，如靶分子范围广、亲和力与特异性强、合成修饰方便快速、分子量较小、良好的生物兼容性、无毒、体外稳定性好等。

目前人们研究和报道的绝大多数核酸适体都是通过SELEX技术获得的。SELEX技术即配体指数富集系统进化技术（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment），主要是基于达尔文的进化论思想：变异、选择、复制，在试管里模拟自然环境中的进化过程，在很短的时间内筛选出符合特定要求的核酸适配体。该方法最早由Larry Gold、Jack Szostak及Gerald Joyce于1990年提出。（3.C.Tuerk,L.Gold,Systematic evolution of ligands by exponential enrichment:RNA ligands to bacteriophage T4DNA polymerase,Science[J].1990,249,505-510;4.A.D.Ellington,J.W.Szostak,Invitro Selection of RNA Molecules That Bind Specific Ligands,Nature[J].1990,346,818-822.）伴随着功能核酸在生物学、医药学、环境和疾病检测等方面逐步扩大的影响和应用前景，如何准确、高效、经济地获得更多的功能核酸也成为人们关注的焦点。在至今的二十多年里，SELEX技术不断被研究者革新、创新，筛选方式更是变得灵活多样，筛选的靶分子也从金属离子、有机小分子、蛋白质等拓展到了细胞、组织等复杂靶标，显示了该技术强大的应用空间。

SELEX最基本的筛选途径是：首先，将大容量的随机寡核苷酸序列库（1013～1015个随机寡核苷酸序列）与靶分子共同孵育，通过各种分离途径将靶标分子-寡核苷酸复合物与未结合的寡核苷酸序列分离。再通过热变性等洗脱方式获得与靶分子结合的寡核苷酸序列，并对这些序列进行聚合酶链式反应（PCR），扩增生成次级文库，用于下轮筛选。如此数轮反复筛选后得到富集文库，对该富集文库进行细菌单克隆并测序，最终获得能够特异性识别靶分子的寡核苷酸序列，即核酸适配体。用于筛选的随机寡核苷酸库的两端通常为固定序列，与PCR扩增的引物序列匹配；中间为15～60个碱基的随机序列，几乎涵盖了所有可能的立体构象，理论上可以针对任何靶分子筛选出特异性的核酸适配体。

SELEX技术是一个相对复杂的过程，其筛选成功率受到众多因素影响，如文库的设计、分离技术的针对性和普适性、靶分子的结构性质、缓冲液的类型以及所含离子种类等。目前尚未有报道针对任意靶标的标准SELEX筛选方法。通常蛋白质或小分子靶标须进行8-12轮筛选，细胞、组织等甚至需要20轮，耗费大量人力和时间，也同时限制了核酸适体的发展。