[发明专利]确定核酸混合物中核酸组成的方法

说明书

本发明提出了一种确定包含第一核酸和第二核酸的总核酸混合物中核酸组成的方法，包括：1)利用重亚硫酸盐对所述总核酸混合物进行处理，以便将所述总核酸混合物中的非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶，并获得经过转化的总核酸混合物；2)利用第一扩增引物组和第二扩增引物组，对所述经过转化的总核酸混合物进行多重荧光定量PCR；以及3)基于所述预定核酸片段的甲基化扩增产物和非甲基化扩增产物的比例R，所述预定核酸片段在第一核酸中的甲基化比例为M₁，所述预定核酸片段在第二核酸中的甲基化比例为M₂，确定总核酸混合物中的核酸组成。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的，涉及确定核酸混合物中核酸组成的方法，更具体的，涉及一种确定包含第一核酸和第二核酸的总核酸混合物中第一核酸含量的方法。

背景技术

产前诊断，是指在胎儿出生之前，应用多种检测手段，如影像学、生物化学、细胞遗传学及分子生物学等技术，对胎儿先天性缺陷或遗传性疾病进行诊断，是最为有效的降低出生缺陷的方式之一。

自从1997年有研究发现孕妇外周血中存在胎儿游离DNA，该项发现则为无创性产前筛查带来新的机遇。

目前利用孕妇血浆测序检测胎儿染色体非整倍体的方法中，通常是通过对孕妇血浆中总的游离DNA进行测序分析，不区分胎儿和母体DNA，而基于显著性检验的原理来判断胎儿是否为染色体非整倍性变异。该方法在无创性的三体筛查中具有一定优越性，但在胎儿DNA浓度较低的条件下，则可能由于染色体异常的显著性较低而出现假阴性结果。

因而，目前需要对孕妇血浆中胎儿DNA浓度进行定量，但手段仍有待改进。

DNA甲基化(DNA Methylation)是指在DNA甲基转移酶的催化下，在胞嘧啶的第五位碳原子上加一甲基基团，使之变成甲基胞嘧啶的化学修饰过程。这种DNA甲基化修饰可以是个体、组织或细胞等具有特异性的，因此可以根据特定基因的甲基化情况区分不同来源的DNA(如胎儿和母体DNA，或肿瘤和正常DNA)，并对其中某个来源的DNA进行定量。

对于癌症早期检测，特定基因的甲基化由于与癌症的发生发展密切相关，因此可作为潜在的早期诊断标志物。以结直肠癌为例，又称大肠癌，包括肿瘤在大肠，直肠及阑尾的增生。在西方世界里，这是第三个最常见的癌症，并且第二个导致死亡的癌症。一般认为，许多大肠癌是从大肠里的腺瘤性息肉(Polyp)所引发的。这些形状与蘑菇相似的肿瘤一般都是良性的，但过了一定的时间其中的一些肿瘤会演变成癌症。结肠癌早期还未发生转移时，能够通过外科手术进行有效治疗并延长生存期。因此，结直肠癌的早期检测是决定能否成功和完全治愈的一个关键环节。高特异性和高敏感性的标志物对于结直肠癌的诊断至关重要，比如血清和排泄物等的DNA异常高甲基化的定性定量检测，是一种新兴的具有高潜力的非侵袭性结直肠癌筛查方法。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效确定包含多种来源核酸的核酸混合物中核酸组成的方法。