[发明专利]兼性减毒细菌种类及其制备和使用方法

说明书

相关申请案的交叉引用

本申请要求2012年11月6日提交的美国临时申请第61/723,234号的权益，其特此以其整体包括所有表格、附图和权利要求在内并入。

发明背景

下面对发明背景的讨论仅仅是为了帮助读者理解本发明而提供而未被承认用于描述或构成本发明的现有技术。

根据定义，病原生物能够在受感染的宿主中引起疾病。为了临床使用这类生物，常常产生表现出毒力降低或消除，但是仍然保持刺激针对目标病原体或异种抗原的所需免疫反应的足够活力的减毒疫苗菌株。已经证明减毒载体平台在许多实验模型，包括传染病和恶性疾病中，引起对编码的异种抗原有特异性的保护性反应。

虽然大多数减毒疫苗载体为病毒性的，但是已经开发出细菌疫苗载体平台供预防和治疗应用。许多其它病原菌的减毒菌株目前可用并且生成重组菌株易于操纵提供了将细菌用作许多外源蛋白，例如与传染病和癌症相关的抗原的有效递送媒介物的方式。尤其，已经由李斯特菌(Listeria)、埃希氏菌(Escherichia)、沙门氏菌(Salmonella)、志贺菌(Shigella)、乳酸杆菌(Lactobacillus)和耶尔森氏菌(Yersinia)种类开发出了活减毒细菌疫苗菌株。

虽然这种疫苗菌株可能表现出毒力降低，但是其安全性，特别是在免疫力低下的个体中，仍令人担忧。进一步降低细菌疫苗风险的策略的一个实例为所说的杀死但具有代谢活性(“KBMA”)的方法。通过DNA修复基因例如uvrA和uvrB的缺失，消除核苷酸切除修复的能力，构建KBMA疫苗菌株。基因缺失致使细菌对通过补骨脂素和UVA联合治疗的光化学灭活极其敏感。由于其不能修复所形成的补骨脂素诱导的DNA交联，所以KBMA细菌菌株无法复制并且因此在功能上无感染性。与活减毒菌株相比，这种特征提供了改善的安全性。然而交联数量非常有限保存了其代谢活性，包括抗原表达，并因此保存其免疫潜力。然而，生产表现出一致性质的KBMA菌株可能很难，因为对交联数量的滴定取决于许多难以控制的变量。

在本领域中仍然需要提供具有有利安全性，用于治疗或预防具有风险-效益，不适于活减毒疫苗的疾病的减毒细菌疫苗菌株。

发明概述

本发明提供了兼性减毒细菌种类及其制备和使用方法。如本文所使用的术语“兼性减毒”指包含一组限定重组修饰的细菌，所述重组修饰当所述细菌在其宿主生物外部时，大体上对所述细菌通过增殖而生长的能力无影响，但是当将所述细菌引入其宿主生物，例如接种受者的宿主细胞内时，导致所述细菌增殖所必需的一个或多个基因缺失。这些重组修饰利用优先诱导基因在哺乳动物宿主内表达的调控序列。

如下文所述，所述细菌最优选为细胞内病原体，例如单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogene)。

在本发明的第一个方面，本发明涉及一种构造细菌以使所述细菌基因组内对所述细菌的增殖必需的一个或多个基因缺失的方法，所述缺失优先在将所述细菌引入宿主时发生。所述方法包括：

(i)向所述细菌内重组引入编码与所述细菌异源的重组酶的核酸，其中编码所述重组酶的所述核酸与优先诱导所述重组酶在哺乳动物宿主内表达的调控序列可操作地连接，和

(ii)在所述细菌基因组内，在对所述细菌增殖必需的基因上游重组引入所述重组酶的第一附着位点，并且在对所述细菌增殖必需的基因下游重组引入所述重组酶的第二附着位点。

所述重组酶当在所述哺乳动物宿主内特异性诱导和表达时，催化使两侧为所述第一和第二附着位点，对所述细菌增殖必需的基因缺失的位点特异性重组事件。在该位点特异性重组事件之后，所述细菌具有增殖缺陷。

如本文所使用的短语“大体上对所述细菌通过增殖而生长的能力无影响”指其中菌落形成为其它方面相同，但是缺乏上述的限定重组修饰的细菌的至少75％的细菌。为方便起见，本文将缺乏经重组引入的重组酶序列和经重组引入的第一和第二附着位点的这种细菌称为“野生型”细菌。在优选的实施方案中，菌落形成为野生型细菌的菌落形成的至少80％，更优选为野生型细菌的至少90％，并且最优选为野生型细菌的至少95％。在体外菌落形成试验中测定菌落形成，并且表示为菌落形成单位(CFU)。