[发明专利]兼性减毒细菌种类及其制备和使用方法

权利要求书

1.一种构造细菌以使所述细菌基因组内对所述细菌的增殖必需的一个或多个基因缺失的方法，所述缺失优先在将所述细菌引入哺乳动物宿主时发生，所述方法包括：

(i)向所述细菌内引入编码与所述细菌异源的重组酶，与优先诱导所述重组酶在所述哺乳动物宿主内表达的调控序列可操作地连接的核酸，和

(ii)在所述细菌基因组内，在对所述细菌增殖必需的基因上游引入所述重组酶的第一附着位点，并且在对所述细菌增殖必需的基因下游引入所述重组酶的第二附着位点，以致所述重组酶在所述哺乳动物宿主内表达时，催化使两侧为所述第一和第二附着位点，对所述细菌增殖必需的基因缺失的位点特异性重组事件，其中在所述位点特异性重组事件之后，所述细菌具有增殖缺陷。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细菌为细胞内病原体，并且当所述细菌在哺乳动物宿主细胞内并且最优选为兼性胞内细菌时，所述调控序列优先诱导所述重组酶的表达。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述细菌为选自以下的属：李斯特菌属、奈瑟球菌属、分支杆菌属、弗朗西斯菌属、杆菌属、沙门氏菌属、志贺菌属、耶尔森氏菌属、布鲁氏菌属、军团菌属、立克次氏体属和衣原体属。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述细菌为单核细胞增多性李斯特菌。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述细菌为单核细胞增多性李斯特菌，其中所述单核细胞增多性李斯特菌为ΔActA/ΔInlB。

6.根据权利要求4所述的方法，其中所述调控序列包括为PrfA依赖型的单核细胞增多性李斯特菌启动子。

7.根据权利要求6所述的方法，其中PrfA依赖型启动子选自inlA启动子、inlB启动子、inlC启动子、hpt启动子、hly启动子、plcA启动子、mpl启动子和actA启动子。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述PrfA依赖型启动子为actA启动子。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组酶选自C31整合酶、R4整合酶、TP901整合酶、BT1整合酶、BxB1整合酶、PSA整合酶、Cre重组酶、Flp重组酶、XerC重组酶、λ整合酶、HK022整合酶、P22整合酶、HP1整合酶、L5整合酶、γδ重组酶、Tn3重组酶、gin重组酶、RV整合酶、SPBc整合酶、TG1整合酶、C1整合酶、MR11整合酶、370整合酶、K38整合酶、Wβ整合酶和BL3整合酶。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一附着位点为attB位点而所述第二附着位点为attP位点。

11.根据权利要求1所述的方法，其中对所述细菌增殖必需的所述一个或多个基因包括涉及DNA复制的至少一个基因。

12.根据权利要求11所述的方法，其中涉及DNA复制的所述至少一个基因选自ori、dnaA、dnaN、gyrA、gyrB、polC、dnaE、ftsK、ftsZ、ligA、dnaG、parC、parE、holB、dnaX、SMC和ftsY。

13.根据权利要求1所述的方法，其中对所述细菌增殖必需的所述一个或多个基因是操纵子的部分，并且所述第一附着位点在整个或一部分操纵子的上游，而所述第二附着位点在整个或一部分操纵子的下游。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述第一附着位点在所述操纵子的上游，而所述第二附着位点在所述操纵子的下游。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组酶为Cre重组酶，所述调控序列包括actA启动子，所述第一和第二附着位点包括loxP位点，并且两侧为所述第一和第二附着位点、对所述细菌的毒力必需的所述基因涉及DNA复制。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一和第二附着位点位于长度为约20kb或更小的核酸序列的侧面。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述核酸序列的长度为约10kb或更小。

18.根据权利要求16所述的方法，其中所述核酸序列的长度为约6kb。