[发明专利]用于核酸测定的对照

说明书

相关申请

该申请要求享有对2012年8月30日提交的美国临时申请号61/695,116的优先权。该申请的内容在此通过引用以其整体并入本文。

序列表的并入

于2013年8月30日创建并且大小为1 KB、命名为“41432-508001WO_ST25.txt”的文本文件的内容，在此通过引用以其整体并入本文。

发明领域

本发明涉及通过在分离或提取方法的不同步骤中使用对照颗粒从微泡（microvesicle ）分离微泡级分和核酸的试剂盒和方法。

背景

将通过细胞释放的膜结合小泡描述为“微泡”。微泡可以包括外来体、外来体样颗粒、前列腺小体、外泌体（dexosomes）、肿瘤细胞胞外体（texosomes）、核外颗粒体、核内体（oncosomes）、凋亡小体、逆转录样颗粒和人内源性逆转录病毒（HERV）颗粒。研究已经显示处于正常和病理状况的多种不同细胞类型释放微泡（Thery 等, 2002）。重要地，已经显示微泡含有DNA、RNA和蛋白质。最近的研究已经显示微泡的内容物的分析已经揭示生物标记物或疾病相关基因可以被检测，因此，证明了微泡分析用于帮助对疾病或其它内科疾病的诊断、预后、监测或治疗选择上的价值。

使用了多种分子诊断测定，以检测疾病相关生物标记物，并且为患者、医生、临床医师和研究者提供了有价值的信息。用于诊断目的的从微泡提取的核酸的分析由于其非侵入的性质（微泡可以容易地收集到其中）而具有广范的影响。微泡分析的使用替代侵入性活组织检查（invasive tissue biopsy）会积极影响患者福利，改善进行纵向疾病监测的能力，并且改善获得表达概况的能力，即使在当组织细胞不容易得到时（例如，在卵巢癌和脑癌患者中）。因此，需要开发额外的工具以确保在临床领域使用的诊断性微泡分析的一致性、可靠性和适用性。没有适当的内部对照，核酸分析结果可能是不一致的并且因此对临床诊断不实用。为解决在微泡诊断领域内的该需求，本发明提供了使用对照颗粒作为用于分离微泡和/或从微泡提取核酸方法的内部对照的方法和试剂盒。

发明概述

本发明涉及使用对照颗粒作为内部对照，用于分离微泡和/或从微泡提取核酸的方法，和可用于该方法的对照颗粒。特定地，本文中提供的方法对鉴别从分离的微泡中提取的高质量提取的核酸样品有用，其适合用于进一步诊断或预后分析。

本发明特征在于从生物样品分离微泡和/或从微泡提取核酸的方法，其通过：a）向生物样品添加含有对照核酸的已知量的对照颗粒，b）从生物样品分离级分，c）从级分提取核酸，d）计算从分离和核酸提取步骤回收的对照颗粒的量，并且e）确定对照颗粒回收的量（在（d）中计算）是在预定数值范围内，以鉴别微泡分离和/或核酸提取的质量。提取的核酸包括来自微泡的核酸和来自对照颗粒的对照核酸。计算步骤可以包括确定对照颗粒的对照核酸的表达水平或拷贝数量。在另一个实施方案中，对照颗粒可以在微泡级分分离后和核酸提取步骤之前添加至样品。

如果在步骤（d）中计算的对照颗粒的量在预定数值范围内，则微泡分离和/或核酸提取的质量是高的。如果在步骤（d）中计算的对照颗粒的量不在预定数值范围内（即，在范围之外），则微泡分离和/或核酸提取的质量是高的。

预定数值范围根据参考样品（即，患者组群（ patient cohort））的集合确定。例如，计算来自参考样品集合的全部回收的或检测的对照核酸的表达水平（即，Ct值）的平均值和标准偏差。预定数值范围可以是，例如，距离参考样品集合的回收的对照核酸的平均表达水平（即，Ct值）1个标准偏差、2个标准偏差、3个标准偏差、4个标准偏差或5个标准偏差。

本发明提供了用于分离微泡和从分离微泡提取核酸的方法的内部对照，以鉴别对于疾病相关生物标记物的准确的和可靠的进一步分析为高质量的提取的核酸样品。例如，对于与医疗状况或疾病相关的至少一种生物标记物的存在、不存在或水平的改变，对提取的核酸进一步分析，以诊断、预测或监测疾病或医疗状况。通过实时PCR（real-time PCR）执行对照核酸表达水平或至少一种生物标记物的存在、不存在或水平改变的分析。

对照颗粒是病毒颗粒，诸如RNA噬菌体。优选地，对照颗粒是Q-β噬菌体。对照核酸是编码Q-β外壳蛋白的基因或其片段。对照颗粒可以是天然生成的或重组的或工程改造的病毒颗粒。