[发明专利]直接核酸扩增试剂盒、试剂和方法

说明书

发明领域

本发明涉及核酸扩增的领域，特别是涉及使用聚合酶链反应扩增核酸的用途。为容易地扩增核酸样品，本发明提供可用于通过冻干或冷冻-干燥核酸扩增试剂扩增核酸的方法和试剂盒。本发明具有在容易地处理核酸中的应用和在基因分型、诊断和法医方面是特别有用的。

发明背景

聚合酶链反应(PCR)是用于分子生物学供扩增核酸的常见工具。US4683202 (Mullis, Cetus Corporation)描述了用于扩增在核酸或其混合物中所含的任何所需特定核酸序列的方法。

US5705345 (Lundin等人)描述了核酸制备的方法，其中含有细胞的样品被溶胞以释放核酸和样品用环糊精处理以中和萃取剂。这种系统的优点是传统的去垢剂去除需要一个分离步骤；然而加入环糊精以中和去垢剂排除了对分离步骤的需要，因此减少了污染的危险。

WO9938962 (Health, Gentra Systems Inc.)描述了一种具有结合的溶胞试剂的固体支持体。溶胞试剂可包含去垢剂、螯合剂、水和任选的RNA消化酶。用于PCR扩增的方法需要纯化核酸用于扩增分析的其它步骤。

WO9102040 (Kosak)描述了在扩增反应混合物中使用环糊精标记的引物用于定性和定量核酸序列分析的发明。该发明的益处是更高的信号效率和标记颜色的通用性。

WO9532739 (Agrawal)描述了与环糊精非共价复合的寡核苷酸。然而环糊精与寡核苷酸的结合是用于寡核苷酸的细胞摄取而不用于PCR反应中的核苷酸的扩增。

WO2010066908 (Beckers等人,)描述了环糊精改进PCR的特异性、灵敏度和/或产率的用途。该方法公开在包含至少一种环糊精的反应混合物中进行的扩增反应且该扩增反应在反应混合物上进行。该PCT申请公开了用于在样品中扩增目标核酸的试剂盒，所述试剂盒在同一容器中包含至少一种环糊精和至少一种选自PCR试剂列表的成分。该申请还公开试剂盒可作为包含几种成分的预混合物提供，其也可以脱水的冻干的形式提供。然而，该申请中没有这样冻干的预混合试剂盒或者甚至此类试剂盒可如何制备的实例。

用于DNA扩增的当前方法涉及通常包含几个步骤的DNA纯化程序，其增加污染的机会。这是一个繁琐的过程，而现有技术的方法在成本、复杂性和特别是用户的时间方面具有许多明显的缺点。例如，基于柱的核酸纯化是典型的纯化核酸的固相提取方法。这种方法依赖于通过吸附结合于二氧化硅或其它支持体(取决于缓冲液的pH和盐含量)的核酸。合适的缓冲液的实例包括Tris-EDTA (TE)缓冲液或磷酸盐缓冲液(由于反应性胺而用于DNA微阵列实验)。在这样的离心柱(spin column)上的核酸纯化包括许多复杂和繁琐的步骤。在离心柱上的核酸纯化通常包括3个耗时和复杂的步骤/阶段：

将含有核酸的样品加入到柱中和由于结合溶液的较低的pH (相对于在柱上的硅烷醇基)和盐浓度所致核酸结合，所述结合溶液可含有缓冲液、变性剂(如盐酸胍)、Triton X-100、异丙醇和pH指示剂；

用5 mM KPO₄ pH 8.0或类似的，80% EtOH)洗涤柱；和

用缓冲液或水洗脱柱。

备选方法包括在离液剂的存在下核酸的结合，以致DNA结合于二氧化硅或玻璃颗粒或玻璃珠。这个属性被用于在碱性条件下使用玻璃粉末或二氧化硅珠纯化核酸。典型的离液剂包括硫氰酸胍                                               或盐酸胍，最近玻璃珠已被含有玻璃的微柱取代。

定量实时逆转录聚合酶链反应的某些缺陷，包括抑制剂的作用，由Bustin & Nolan (J. Biomolecular Techniques, 2004, 15, 155-166)描述。

在法医应用中针对PCR扩增失败的最好防御是将合理的样品处理和加工技术与被证明有效纯化DNA的提取系统结合。

典型地，PCR试剂贮存在必须维持在低于室温的温度下的甘油溶液中。冻干法或冷冻干燥是一种广泛用于制备供核酸分析和其它生物过程的试剂的方法，因为它允许否则不稳定的生物分子的长期稳定性，并提供一种储存、运输和重构的便利方法。然而在涉及制备用于PCR分析的冻干或冷冻-干燥的试剂方面存在许多技术挑战。制备干燥生物试剂组合物的当前技术包括诸如干式混合、喷雾干燥、冷冻干燥、流化床干燥和/或低温冷冻的步骤。所有这些步骤都有限制和缺点，包括一致性和可靠性。