[发明专利]B型肝炎病毒表面抗原基因中止型突变的侦测技术

说明书

技术领域

本发明原则上系关于肝细胞癌(hepatocellular carcinoma)，特别是与B型肝炎病毒有关的肝细胞癌。

背景技术

B型肝炎病毒表面抗原基因(Gene S of hepatitis B virus)负责编码表面抗原HBsAg。该B型肝炎病毒表面抗原基因(HBsAg gene)为一个长的开放转录区(long open reading frame)，但该转录区内有3个起始密码子(start codon,ATG)，进而将该HBsAg基因分成3个部份—pre-S1、pre-S2和S。因为具有多个起始密码子，该基因负责编码的多胜肽共有3种不同的大小—大(large)S、中(middle)S和小(small)S；其中大S是由pre-S1+pre-S2+S来编码，中S是由pre-S2+S来编码，小S是由S来编码。在慢性B型肝炎感染的过程中，病毒基因组经常会发生突变。这些突变是因为这些病毒试图要逃脱寄主的免疫监视(host immune-surveillance)。

B型肝炎病毒相关的肝癌变(Hepatocarcinogenesis)被认为是一种打带跑(hit-and-run)的事件，因为大部分手术移除的肝癌癌组织中，很少发现有可自由复制的病毒的存在。因此，若是有某种病毒突变被认为和癌症发生的过程有关，但常无法被确认，这是因为突变病毒在肝癌形成的后续阶段中已经不存在了。

发明内容

本发明系关于一种于体外侦测一分离出的核苷酸检体具有一B型肝炎病毒表面抗原基因C端截断突变(c-terminal truncation mutation)的方法，其中该表面基因负责编码一小表面蛋白质(small S protein)，而该方法包括下列步骤:

a)提供第一组引子(first primer pair)和第二组引子(second primer pair):其中该第一组引子包括一第一前置引子(first forward primer)和一反置引子(reverseprimer)；其中该第二组引子包括一第二前置引子(second forward primer)和一反置引子(reverse primer)；另，(1)该第一前置引子包括：一段会黏合(annealing)至S基因5'端(5'-end)的核苷酸序列，且该核苷酸序列的5'端标记有一FLAG标记序列(FLAG tag sequence)；该反置引子具有可黏合至S基因3'端(3'-end)序列的特征；该第一组引子具有产生第一次PCR产物的特征，该第一次PCR产物于5'端包括一FLAG标记序列；(2)该第二前置引子由5'端至3'端的方向(5'～3'direction)包括一T7或Sp6启动子序列、一Kozak序列(Kozak sequence)、一3'端序列，且该3'端序列可黏合至第一次PCR产物5'端的FLAG标记序列；而该第二组引子具有产生第二次PCR产物的特征，该第二次PCR产物包括其5'端具有T7或Sp6启动子序列，具有Kozak序列和FLAG标记序列，其中该Kozak序列位在T7或Sp6启动子序列和FLAG标记序列之间；

b)于一第一反应混合物中进行一第一次PCR，该混合物包括一分离出的核苷酸检体和第一组引子来产生第一次PCR产物，其中该分离出的核苷酸检体来自于B型肝炎病毒带原者(HBV carrier)或B型肝炎病毒疑似带原者；

c)于第二反应混合物中进行一第二次PCR:该混合物包括第一次PCR产物和第二组引子来产生第二次PCR产物；

d)将第二次PCR产物转译成一蛋白质；

e)将该蛋白质的尺寸(size)与控制组或野生型的小表面蛋白质做比较；及

f)决定该核苷酸检体是否具有B型肝炎表面基因的C端截断突变:该蛋白质与控制组或野生型的小表面蛋白质做比较，若其尺寸较小，则该检体具有B型肝炎表面基因的C端截断突变。

另一方面，本发明系关于一种于体外侦测一核苷酸检体至少具有一个B型肝炎病毒表面抗原基因C端截断突变的方法，该方法包括下列步骤：

a)提供一第一前置引子和一反置引子；其中该第一前置引子包括一段用于黏合至S基因5'端(5'-end)的核苷酸序列，且该核苷酸序列的5'端具有一FLAG标记序列；该反置引子具有一用于黏合至S基因3'端(3'-end)的核苷酸序列；