[发明专利]用于快速检测扩增的核苷酸序列的方法和设备

说明书

技术领域

本发明涉及用于快速检测来自存在于生物样品中的原始和特定基因序列的(基因)(酶促)扩增的基因序列(扩增子)的方法和设备。

该方法优选设计用于包含不同的多个基因靶序列(寡核苷酸)的样品的诊断应用，(i)用于快速且有效地检测样品中的特定核酸序列，以及该检测与该测试样品所来自的个体的不同病理和疾病，具体地感染性疾病、菌血症、呼吸道或肠道传染病的相关性，包括对于治疗性试剂如抗生素的抗性形式，(ii)用于识别食品的污染物，或(iii)用于预后测试，尤其是检测可能存在于样品中的癌症标记物。

背景技术

在(基因)扩增方法中，聚合酶链式反应(PCR)是在分子生物学中最常用的用于获得可能存在于生物样品中的一个或多个拷贝的原始和特定核苷酸序列的特异性扩增的技术。通过连续的(基因)扩增循环，该技术允许产生百万甚至千百万的原始和特定序列的拷贝。该PCR扩增方法包括在若干(2个或3个)特定的温度加热和冷却的重复热循环，用于变性该核苷酸序列、用于引物的杂交以及杂交引物的初始核苷酸序列的酶促延长。

该方法通过程序化仪器的实现，通过连续的热循环，具体地重复的和连续的温度升高和降低的循环，该程序化仪器加热和冷却包含将要扩增的样品的靶基因序列的固定反应室。

通过仪器的加热块(block)的加热和冷却速率限制扩增速率。

为了降低用于(多个)PCR扩增的总时间，已提出了多种方法。它们中的一种由连续动态流动下实现PCR扩增组成。

用这种技术，可以使得样品在稳定流下通过(微)通道，通过2个或3个不同的空间区域，每个具有恒定的温度。

Kopp等的文章(1998,Science 280,1046-1048)特别描述了这类设备。该设备包括多次通过具有不同的变性、杂交和延长温度的3个区域的通道。在通道的一端引入样品并且朝着通道的另一端的方向泵入，在该通道的另一端回收该扩增的样品以便于分析。

以小型化形式和以连续(恒定)动态流动的(基因)扩增也要求检测扩增的核苷酸序列。

在Kopp等的文章中，通过在扩增设备外用溴化乙锭着色的凝胶上的电泳分析该扩增的样品。

因为PCR是极其灵敏的扩增技术，因而可以扩增能够污染样品的非常小量的核苷酸序列(特别是来自之前的扩增)，产生假阳性结果。考虑到抑制该缺点，最有效的方法由将该(PCR)扩增步骤以及用于检测该扩增产物的步骤集成至同一闭合且一次性的设备中(一次使用(one-use))组成。

存在用于检测的这类集成设备，例如，通过毛细管电泳或通过在微网格板(checkerboard)上杂交。然而，用于测量和分析的这类方法和设备通常是复杂并且是昂贵的。进一步，产生于初步(基因)扩增步骤期间的微泡发射可以干扰这些设备上的检测。

因此，存在对于简化这些方法和设备的需要以简化其使用和效率，降低其成本并且增加其使用的速度。

发明目的

本发明的目的是提供用于优选通过PCR以连续动态流动的(基因)扩增的方法和设备，结合简单且廉价的、并且不具有现有技术的缺点的检测方法和设备。

本发明的具体目的是提供这类方法和设备，其允许快速检测，以及有效率的检测，以获得样品中特定核酸序列存在的分析结果，优选样品的快速和未失真诊断，以及可选地该检测与该样品所收集自的个体的不同病理和疾病，具体地感染性疾病，如菌血症、呼吸道和胃肠道感染性疾病的相关性，包括对治疗性试剂、具体地抗生素的抗性的形式。

发明内容

本发明的第一个方面涉及优选通过PCR的扩增方法，并且涉及可能存在于生物样品优选(i)从动物或个体如哺乳动物、更具体地人提取的样品，或者(ii)食物组合物的污染物中的至少一种和/或至多达数十种(多重检测)靶核苷酸序列的检测方法，所述方法包括以下连续步骤：

a)提供包括以下各项的设备：

-具有包含在约0.01mm至约10mm之间的区段的通道，

-与所述通道流体连通的测试条带，所述测试条带包括：

-与所述扩增的靶核苷酸序列的至少一个第一序列部分互补的第一(一个或多个)和特异性探针，或