[发明专利]用于制备包含特异性结合靶的至少一种结合实体的抗体Fc区缀合物的方法及其用途

说明书

本文报道了通过使用转肽酶(例如分选酶A)酶促制备抗体Fc区缀合物的方法，所述转肽酶用于将至少一种特异性结合靶的结合实体共价连接至抗体Fc-区；以及这一方法用于生成新的例如单特异性或双特异性抗体的用途。

发明背景

单克隆抗体在当今的医学领域中具有巨大治疗潜能并且发挥重要作用。在最近十年期间，制药业中的一个明显趋势已经是开发单克隆抗体(mAb)和抗体Fc-融合多肽(可结晶片段-融合多肽)作为跨多样临床环境的治疗剂，包括肿瘤学、慢性炎性疾病、移植、传染病、心血管医学或眼科疾病(Carter,J.P.,Nature Reviews Immunology 6(2006)343-357；Chan,A.C.和Carter,J.P.,Nature Reviews Immunology 10(2010)301-316)。

治疗性抗体的临床效率主要依赖于两种官能性：i)由Fv域介导的靶特异性结合，和ii)免疫介导的效应子功能如由抗体Fc区介导的ADCC(抗体依赖的细胞介导细胞毒性)、CDC(补体依赖的细胞毒性)和ADCP(抗体依赖的细胞吞噬作用)。IgG类别的免疫球蛋白的Fc区包含铰链区和两个恒定结构域(CH2和CH3)。Fc区还与新生FcRn受体相互作用并且因而决定抗体在体内的半寿期。铰链区是抗体分子的臂形成Y样结构的区域，所述Y样结构使得分子中在此处的灵活性成为可能。一种或多种IgG亚类在二硫键数目和铰链区长度方面不同。

与抗体Fc区相关的效应子功能随抗体类别和亚类变动并且包括例如抗体通过其Fc区与细胞上特定Fc受体(FcR)结合，这触发多种生物学反应(参见例如Jiang,X.-R.等人,Nature Reviews Drug Discovery 10(2011)101-110；Presta,L.G.,Current Opinion in Immunology 20(2008)460-470)。

构成融合多肽或缀合物的抗体或Fc区的铰链区参与至少部分的抗体功能如抗原结合和Fc区介导的抗体效应子功能。尽管抗原结合(尤其二价亲合抗体结合)取决于特定/天然铰链区的灵活性、长度和空间取向，Fc区介导的效应子功能依赖于抗体的类别和亚类。与其他IgG抗体的二价相比，对一些人IgG4抗体观察到的功能性单价是显示Fc区参与抗原结合特性的另一个例子。

在WO2010/087994中，报道了用于连接的方法及其用途。在WO2010/099536中，报道了针对DOTA螯合物具有高亲和性的改造的蛋白质。

发明简述

已经发现在转肽酶，例如分选酶A，催化的酶促缀合反应中，副反应产物的形成可以被减少或者甚至被消除，如果使用特异性改造的分选酶基序与特异性改造的Fc区的组合。

特别地，

i)基于将产物缀合物中的LPX1TG(SEQ ID NO:01)氨基酸序列识别为底物的逆反应，和/或

ii)封端水解多肽片段(无/切割的LPX1TG识别序列的多肽，通过由水而非寡聚甘氨酸亲核体切割硫代酰基-转肽酶中间体而产生)的生成，

可以在酶促缀合反应中被减少甚至被消除如果使用

i)抗体Fc区，其至少在其N末端之一包含寡聚甘氨酸(Gm，m＝2，或3，或4，或5)，以及

ii)特异性结合靶的结合实体，例如单链抗原结合多肽(例如scFc，scFab和darpin)或多链抗原结合多肽(例如dsFv和Fab-抗体片段)，其在其C末端区域中包含G_nSLPX1TG(SEQ ID NO:02,n＝1,2,或3，且其中X1可以是任何氨基酸残基)氨基酸序列。

此外，已经发现通过使用上述C-末端和N-末端氨基酸序列的组合，可以获得改善的反应产量。

本文报道的一个方面是使用用于将抗体Fc区酶促缀合至至少一个结合实体的转肽酶，从专有地重组产生的起始多肽产生抗体Fc区缀合物的方法，所述抗体Fc区缀合物包含含有抗体Fc区的第一重组组分和含有至少一个特异性结合靶的结合实体的第二重组组分。

在一个实施方案中，转肽酶是分选酶A。在一个实施方案中，分选酶A是金黄色葡萄球菌分选酶A。