[发明专利]用于流式细胞术的样品制备

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年4月5日提交的美国第61/620,823号临时专利申请的申请日的权益，并且本申请与2013年3月13日提交的美国第61/779,766号临时申请相关，该申请与本申请是共同拥有的，这两个申请的公开的内容通过参考结合于此。

背景技术

确定特定样品中活的生物体的身份和总数非常重要。通过监督和食物中致病菌的鉴定快速、有效、准确地监控和确保食物和供水的安全尤为重要。

总活的生物体(total viable organism，TVO)测定是实现上述目标的一种这样的方法。目前，TVO测定技术作为一种质量控制应用广泛用在工业微生物学领域。例如，TVO测定用于监控消费类食物产品——例如肉类——中的细菌数量和类型。TVO方法也可以用于监控饮用水中的细菌群落。当然，监控食品和饮用水对保障食品和供水消费安全是至关重要的。

TVO测定的步骤总体上包括：1)获取测样品品；以及2)在放置在适宜容器中的琼脂(一种凝胶状的营养基)上培养样品或者直接涂覆样品。这样，微生物得以生长，并且基于形成于琼脂之上的菌落数，可以计算多个菌落形成单位(CFU)。仅在菌落生长的允许时间之后，可以计算CFU。计算CFU时，通常要将样品进行稀释，并考虑该稀释因数(即样品和总体积的体积比率)。

也可以将样品放置于各种各样的琼脂板上培养，琼脂板含有不同类型的选择性培养基以帮助隔离目标微生物，并且更准确和可靠地确定存在何种类型的微生物。选择性试剂(例如抗生素，抗真菌药剂等)将消除某些非目标微生物(例如，不感兴趣的细菌)。如果形成来自于许多不同类型的微生物的群落，则这样可以避免可能产生的假性结果的可能性。

选择性试剂还可以优于其他试剂促成某些类型的微生物的生长。尽管TVO测定考虑到检测不同的微生物种群——例如不同的细菌种群，但食品和环境微生物学家必须经常在枚举和鉴定两者之间在没有二者的选择能力的情况下进行选择。虽然可以增加选择性试剂以促成特定群组的菌类的生长，但是TVO测定经常要基于在富营养培养基中繁殖正常的健康细胞的能力(即没有选择性)。因此，TVO具有测量被测样品中微生物总数或微生物的群组的能力。然而，因为缺乏区分特定微生物的能力，TVO整体来看可以是对于微生物种群来说是相对非特异性的。

识别特定微生物，尤其是病原体可用的方法很多。这样的方法广泛应用于临床环境。检测微生物的方法经常依赖于微生物培养的富集以增加目标微生物的数量，以及允许受损微生物的恢复。当使用选择性和区分性平皿培养(plating)时，研究人员能够将目标生物体从背景微生物群落中区分开来。然而，结果几乎总是不可计数的。换言之，仅可以确定特定的细菌种群的存在或者不存在，而非数量。

利用样品富集和选择性平皿培养二者都是很耗时的测定，它们在甚至可以得到初步的结果之前，也经常要花费数天时间。尽管这样的富集或者选择性平皿培养是确定样品中微生物的数量和种类的最基本的程序，但要在计数琼脂上生长的菌落后典型地花费数天得到最终的结果。得到结果所花费的时间的总量是利用最基本的TVO测定的最显著的缺陷。

通过取消选择性和区分性平皿培养步骤来试图缩短检测时间的不同方法已经得到开发。这些方法包括DNA杂交，凝集，以及酶免疫分析法。尽管这些可供选择的技术已经缩短了用于检测的时间，但培养富集步骤仍然是必须的，原因在于这些方法只允许目标病原体的10³–10⁴CFU的最终检测。因此，对于TVO测定来讲，对于假定地阳性结果的确认仍然是必须的。

进一步来说，不存在用于分析生物样品——尤其是食物样品——以检测多种微生物的存在或者不存在的通用方法或者单一技术。这使得在用于微生物的测定前用于从生物样品中的微生物的分离和随后的浓缩的样品制备步骤成为用于病原体——包括食物源性病原体——的检测的分子方法中的限制步骤。

至于用于微生物的分离的特异性样品制备技术，利用离心法然后进行洗涤和过滤步骤的技术是不利的，因为在处理过程中，它们会导致微生物的显著损失或者对微生物的损伤。进一步来说，整个程序不适合于自动化操作。

为实现从样品中分离微生物，已经使用针对特定微生物的亲和剂。然而，用于从复杂基质中隔离微生物的亲和剂的有效利用也是很复杂的，原因如下：1)缺乏从其他的样品组分中选择性地结合所有的生物体的通用亲和剂；2)对于通用的亲和试剂，结合不同的生物体的亲和性的变化性；3)很难将结合后的生物体洗脱回到溶液中。