[发明专利]人源化抗体表达载体及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于载体构建领域，具体地说，本发明涉及一种人源化抗体表达载体及其构建方法。

背景技术

由于单克隆抗体的高度特异性，使其在细胞生物学、基础医学、临床诊断、治疗等领域得到了广泛的应用。但同时单克隆抗体也存在一些缺陷，鼠源性抗体应用于人体会产生抗鼠抗体反应(HAMA)等,会妨碍其在临床上的应用。为了克服单克隆抗体的缺点，利用基因工程技术制备嵌合抗体，人源化抗体等，在尽量保留原有抗体的特异性的前提下减少了抗体中的鼠源成分。

目前构建嵌合抗体，完整的人源化抗体等一般需要先扩增出人源性抗体的轻重链恒定区基因，然后通过重叠PCR的方法与所需表达抗体的可变区相连后再构建至表达载体中，该过程比较费时、费力。

另外目前常用的噬菌体抗体库等筛选方法所筛选出来的抗体一般为ScFv，Fab等，还需要进一步构建全长的完整抗体。

发明内容

基于此，本发明克服了上述现有技术的缺陷，提供了一种完整的人源化抗体的表达载体的快速构建方法。

一种人源化抗体表达载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)将碱基组成如SEQ ID NO:6所示的含有2A序列的轻链λ的恒定区基因序列CL-2A与碱基组成如SEQ ID NO:7所示的重链γ1的恒定区基因序列CH分别与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，得到pMD18-T-CL-2A质粒和pMD18-T-CH质粒；

(2)将pMD18-T-CL-2A质粒和真核表达载体分别用HindIII和BamHI进行双酶切，将分离纯化后的酶切产物进行连接，转化大肠杆菌，筛选获得含CL-2A的真核表达载体；

(3)将步骤(2)的含CL-2A的真核表达载体和步骤(1)的pMD18-T-CH质粒分别用XbaI和XhoI进行双酶切，将分离纯化后的酶切产物进行连接，转化大肠杆菌，筛选获得人源化抗体表达载体。

在其中一个实施例中，所述含有2A序列的轻链λ的恒定区基因序列CL-2A是通过以下步骤制备得到的：

将健康人淋巴细胞的总RNA，反转录成单链cDNA，以单链cDNA为模板，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2为扩增引物，进行第一次PCR扩增，得到PCR产物；以所述PCR产物为模板，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3为扩增引物，进行第二次PCR扩增，得到含有2A序列的轻链λ的恒定区基因序列CL-2A。其中，

C_L上游引物：AAGCTTCAGCCCAAGGCTGCCCCCT(SEQ ID NO:1)，含有HindIII酶切位点；

C_L下游引物1：

CCAACTTGAGCAGGTCAAAGTTCAAAAGCTGCTATGAACATTCTGTAGG(SEQ ID NO:2)

C_L下游引物2：

GGATCCGGGCCCAGGATTGGACTCAACGTCCCCCGCCAACTTGAGCAGGTCAA(SEQ ID NO:3)，含有BamHI酶切位点；

C_L下游引物1、2中包含了2A的序列，由于2A的序列较长，因此使用两次PCR反应以便把完整的2A的基因序列添加到CL链的末端。

在其中一个实施例中，所述第一次PCR扩增的反应体系为：

反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环后，72℃延伸10min。

在其中一个实施例中，所述第二次PCR扩增的反应体系为：

反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环后，72℃延伸10min。

在其中一个实施例中，所述重链γ1的恒定区基因序列CH是通过以下步骤制备得到的：

以全长人源性质粒H为模板，SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5为扩增引物，进行PCR扩增，得到重链γ1的恒定区基因序列CH。其中：

C_H上游引物：CTCGAGGCCTCCACCAAGGGCCCAT(SEQ ID NO:4)