[发明专利]人源化抗体表达载体及其构建方法

权利要求书

1.一种人源化抗体表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将碱基组成如SEQ ID NO:6所示的含有2A序列的轻链λ的恒定区基因序列CL-2A与碱基组成如SEQ ID NO:7所示的重链γ1的恒定区基因序列CH分别与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，得到pMD18-T-CL-2A质粒和pMD18-T-CH质粒；

(2)将pMD18-T-CL-2A质粒和真核表达载体分别用HindIII和BamHI进行双酶切，将分离纯化后的酶切产物进行连接，转化大肠杆菌，筛选获得含CL-2A的真核表达载体；

(3)将步骤(2)的含CL-2A的真核表达载体和步骤(1)的pMD18-T-CH质粒分别用XhoI和XbaI进行双酶切，将分离纯化后的酶切产物进行连接，转化大肠杆菌，筛选获得人源化抗体表达载体。

2.根据权利要求1所述的人源化抗体表达载体的构建方法，其特征在于，所述含有2A序列的轻链λ的恒定区基因序列CL-2A是通过以下步骤制备得到的：

将健康人淋巴细胞的总RNA，反转录成单链cDNA，以单链cDNA为模板，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2为扩增引物，进行第一次PCR扩增，得到PCR产物；以所述PCR产物为模板，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3为扩增引物，进行第二次PCR扩增，得到含有2A序列的轻链λ的恒定区基因序列CL-2A。

3.根据权利要求1所述的人源化抗体表达载体的构建方法，其特征在于，所述重链γ1的恒定区基因序列CH是通过以下步骤制备得到的：

以全长人源性质粒H为模板，SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5为扩增引物，进行PCR扩增，得到重链γ1的恒定区基因序列CH。

4.根据权利要求2所述的人源化抗体表达载体的构建方法，其特征在于，所述第一次PCR扩增的反应体系为：

反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环后，72℃延伸10min。

5.根据权利要求2所述的人源化抗体表达载体的构建方法，其特征在于，所述第二次PCR扩增的反应体系为：

反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环后，72℃延伸10min。

6.根据权利要求3所述的人源化抗体表达载体的构建方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：

反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min20s，30个循环后，72℃延伸10min。

7.根据权利要求1所述的人源化抗体表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述连接体系为：

pMD18-T载体             0.5μL

CL-2A/CH                4.5μL

Solution Ⅰ             5μL

所述连接条件为22℃连接5h。

8.根据权利要求1所述的人源化抗体表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(1)-步骤(3)中所述转化包括以下步骤：

(a)于30μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中加入2μL连接产物，轻轻旋动以混匀，冰中放置30min；

(b)42℃水浴热激90s；

(c)迅速转移到冰浴中放置2min；

(d)加入1mLLB培养基，于37℃，160rpm振荡培养1h；

(e)取100μL培养液涂布到含有Amp的LB琼脂平板培养基上，将平板置于37℃放置1h后倒置平皿，于37℃培养过夜。

9.根据权利要求1所述的人源化抗体表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述真核表达载体为pcDNA3.1。

10.权利要求1-9任一项所述的构建方法得到的人源化抗体表达载体。