[发明专利]一种用于松木及其制品的松材线虫检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于植物保护领域，涉及一种用于直接检测松木及其制品是否含有松材线虫的检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）是引起松树毁灭性传染病害——松材线虫病的病原物。1982年我国在南京首次发现该病。三十多年来，该病迅速扩散到江苏、安徽、浙江、广东、山东等我国大陆十六个省（区），直接经济损失42亿元，间接经济损失达千亿元。且每年以6000hm²的速度扩散。近年来，疫情逐步向我国北方省份蔓延。据国家林业局林业有害生物检验鉴定技术培训中心的统计，2009年该病已扩散到河南、陕西两省，已对我国部分地区松林资源、自然景观和生态环境造成严重破坏，并对大面积林区及松林景观生态区域构成严重威胁。分析我国疫情发生特点，病害流行大多由人为传播松木及其制品引起。此外，部分地区没能及时监测到疫情存在而导致疫情进一步扩散。松材线虫病之所以能够快速蔓延，畅通无阻，其主要原因之一就是在实践中缺乏快速、有效的检验检疫手段，以至于我国大多数森林植物检疫检查站的日常检疫工作流于形式而没有真正发挥其应有的效能。

由于松材线虫的形态学检疫技术存在一些形态学鉴别特征重叠现象，加之幼虫、雄虫不能够定性鉴定。因此，不少学者开始在遗传学、免疫学、病理学和生理生化（酶学、血清学、性外激素、染色体数）等方面做了大量工作，对于松材线虫的检测起到了积极的作用。

目前在松材线虫的分子检测方面，主要包含三大类。第一类是普通PCR检测方法，如南京农业大学的专利“松材线虫检测试剂盒及其检测方法”（申请号：200310106109.5）以及云南农业大学的专利“一种松树萎蔫病病原线虫的快速检测方法”（申请号：200510048722.5），这些检测方法费时长、检测过程复杂，不便于生产上应用。且未应用于实际生产上；第二类是实时荧光PCR检测方法，如中国科学院微生物研究所的专利“一种检测松材线虫的方法及其专用引物和探针”（申请号：200310109374.9）、上海市林业病虫害防治检疫站和南京农业大学植物保护学院的专利“松材线虫检测试剂盒及其检测方法”（申请号：200510026710.2），以及南京林业大学的专利“一种松材线虫检测试剂盒及其检测方法”（申请号：200810124385.7）等，这些检测方法或多或少地存在检测特异性不强问题、且检测精度还有待提高，因而也没有在生产实践中应用；第三类是恒温扩增检测技术，如南京林业大学与杭州优思达生物技术有限公司的专利“一种定性检测松材线虫的试剂盒及其检测方法”（2012103035323），该项检测技术还有待生产上的验证。

以上松材线虫分子检测方法，首先都必须从可疑松木或松木制品中分离获得线虫，然后再对线虫进行检测、鉴定。仅线虫分离这一项工作就需8-12小时。难以满足各森林植物检疫检查站的快速检疫需求。从快速检疫的角度而言，上述松材线虫分子检测技术与方法距离快速检疫还有一定的差距。为满足检疫检验实践中的快速鉴定要求，有必要开发更为简便、快速、高效的检测鉴定技术与方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能够快速、准确、便利的直接检测松木及其制品是否含有松材线虫的检测试剂盒。

本发明还要解决的一个技术问题是采用上述试剂盒检测松材线虫的方法。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种用于松木及其制品的松材线虫检测试剂盒，其特征在于，它包括以下成分：

（1）松木及其制品松材线虫检测正向引物、反向引物和荧光探针：

正向引物（F）：5′-GAGCAGAAACGCCGACTT-3′；

反向引物（R）：5′-CGTAAAACAGATGGTGCCTA-3′；

荧光探针（P）：5′-FAM-TGCACGTTGTGACAGTCGT-BHQ1-3′；

（2）Premix Ex Taq（Probe qPCR）（2×Conc.）；

（3）阳性对照：松材线虫DNA模板，浓度为0.5-5ng/μL；

（4）阴性对照：灭菌双蒸水；