[发明专利]一种用于松木及其制品的松材线虫检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种用于松木及其制品的松材线虫检测试剂盒，其特征在于，它包括以下成分：

（1）松木及其制品松材线虫检测正向引物、反向引物和荧光探针：

正向引物：5′-GAGCAGAAACGCCGACTT-3′；

反向引物：5′-CGTAAAACAGATGGTGCCTA-3′；

荧光探针：5′-FAM-TGCACGTTGTGACAGTCGT-BHQ1-3′；

（2）Premix Ex Taq；

（3）阳性对照：松材线虫DNA模板；

（4）阴性对照：灭菌双蒸水；

（5）DNA裂解液：2.0～3.0mM二硫苏糖醇，1.0～1.5v/v%吐温20，0.8～1.2mM明胶，1.0～1.5mM KCl，l.0～2.0mM pH8.3三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，3.0～4.0mM MgCl₂；

（6）蛋白酶K。

2.根据权利要求1所述的用于松木及其制品的松材线虫检测试剂盒，其特征在于，所述的DNA裂解液，其配方为：2.0mM二硫苏糖醇，1.0v/v%吐温20，0.8mM明胶，1.0mM KCl，l.0mM pH8.3三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，3.0mM MgCl₂。

3.根据权利要求1所述的用于松木及其制品的松材线虫检测试剂盒，其特征在于，所述的蛋白酶K浓度为20～40mg/mL。

4.根据权利要求3所述的用于松木及其制品的松材线虫检测试剂盒，其特征在于，所述的蛋白酶K浓度为20mg/mL。

5.权利要求1所述的试剂盒检测松木及其制品中松材线虫的方法，其特征在于，它包括如下步骤：

（1）取样：对每份送检松木或其制品，用电钻钻取3～5个不同位置的碎木屑，混合；

（2）DNA的提取：取碎木屑1～2g于50mL的离心管内，使木屑集中在离心管底部，加入5～8mL的DNA裂解液，再加入20～40mg/mL5μL蛋白酶K，将离心管置于68～70℃条件下反应40～45min，然后置于93～95℃条件下反应5～10min；以12000～13000rpm的转速离心3～5min，取上清液100～300μL，置于1.5mL离心管，再向其中加入400～500μL灭菌双蒸水，以12000～13000rpm的转速离心3～5min，取3.5μL上清液，用于检测；

（3）检测体系：总体积10μL，包括5μL Premix Ex Taq、0.5μL10μM正向引物、0.5μL10μM反向引物、0.5μL10μM荧光探针、3.5μL检测样品的上清液；

（4）样品检测：将上述检测体系置于松材线虫自动化分子检测系统进行自动程序检测，自动程序判读检测结果。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，电钻钻头直径为8～10mm。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，取碎木屑1～2g于50mL的离心管内，使木屑集中在离心管底部，加入6mL的DNA裂解液，再加入20mg/mL5μL蛋白酶K，将离心管置于68～70℃条件下反应40min，然后置于95℃条件下反应10min；以12000rpm的转速离心3min，取上清液100μL，置于1.5mL离心管，再向其中加入400μL灭菌双蒸水，以12000rpm的转速离心3min，取3.5μL上清液，用于检测。