[发明专利]一种货架期内具有高活菌数的枯草杆菌微胶囊的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及益生菌微胶囊制备技术领域，具体地说是一种货架期内具有高活菌数的枯草杆菌微胶囊的制备方法。

背景技术

枯草杆菌 (Bacillus subtilis)，是一种好气性革兰氏阳性菌，有鞭毛。枯草杆菌的内生孢子耐高温（120 °C能存活20 min），耐酸碱(100%直达大小肠的活菌)。进入消化道后，在短期内迅速由休眠状态复活，繁殖成高含菌量的优势种群。进而消耗掉肠道内的氧气，产生过氧化氢、细菌素，促进有益厌氧微生物的繁殖，抑制有害细菌（大肠杆菌、沙门氏杆菌）的生长，建立微生态平衡。从而预防腹泻、下痢等肠胃道疾病。枯草杆菌在临床医学上属于安全性的有益微生物，在保健食品中属于益生菌。

益生菌是定植于人体肠道内、生殖系统内，能产生确切健康功效的生活的有益微生物的总称。随着对人们对益生菌了解、重视和研究的深入，益生菌正从保健向医疗领域延伸。然而，益生菌制品在从生产、保藏、运输、经口服过消化道到达肠道的过程中，需要经受一系列不良环境因素的影响，导致到达肠道的活菌数量大大减少，限制了益生菌生理功能的发挥。将益生菌包埋在微胶囊内可减轻环境不良因素的影响，从而提高益生菌的存活率。

可用作微胶囊壁材的材料很多。有天然高分子聚合物、半合成高分子聚合物以及合成高分子聚合物，主要包括：碳水化合物，如海藻酸钠、壳聚糖、淀粉；植物胶类，如阿拉伯胶、κ-卡拉胶；动物蛋白，如牛奶、明胶；细菌多糖，如胶凝糖、黄原胶。用来包埋益生菌的壁材通常应具备如下特征：好的生物相容性和成膜性，合适的粘度、渗透性、亲水性和溶解性等；并具有性质稳定性、能与芯材配合，能生物降解等。对益生菌微胶囊的研究已有诸多报道，但在需氧益生菌微胶囊中还存在有很多不足，如：耐热性差、透气性强和存活期短的问题。解决这些问题的主要出路在于提高菌株的抗逆性和胶囊耐受性。

 

发明内容

本发明公开一种货架期内具有高活菌数的枯草杆菌微胶囊的制备方法，旨在提高枯草杆菌的抗逆性、保藏期，大幅降低活菌经过消化道时的死亡率，使尽可能多的活菌到达肠道定植，起到益生保健作用。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案。

一种货架期内具有高活菌数的枯草杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:

（1） 菌株的活化：将4℃左右的条件下保存小于一个月的枯草杆菌单菌落接种于种子培养基中，在32-45 ℃，100-300 rpm条件下培养12-24 h进行初次活化，然后按1-5%的接种量第二次将初次活化的枯草杆菌培养液接入种子培养基中，在相同条件下培养4-10 h进行再次活化,得活化种子液；

（2）扩大培养：将活化种子液按1-10%的接种量接种于pH6.5-8.5的装有的奶粉-豆粕无菌培养基的发酵罐中，在35-45℃，溶解氧≧35%条件下发酵18-24 h，继续在25-35 ℃发酵18-48 h至内生芽孢生成率≧50%，得发酵液；

（3）洗涤：将发酵液于3000-10000 rpm速度下离心5-30 min,去除上清液，按体积比1：1-5的比例将沉淀的菌体用无菌水振荡混均，与前述相同条件下离心去除上清液，反复洗涤1-3次，随后用1-5%无菌奶粉液重新悬浮菌体，其活菌数≥10¹⁰ cfu/ml，得菌悬液；

（4）单层微胶囊制备：按1-5%（W/V）的比例将无菌处理的海藻酸钠、0.1-1%（W/V）的阿魏酸和1-2%（W/V）的甘油加入菌悬液中，无菌条件下充分搅拌混匀，得菌胶液；以10-30 ml/min流速用注射泵将菌胶液注入无菌的1-10 ℃冷却的1-10%（M/V）的氯化钙溶液中，边滴加边在100--300 rpm下搅拌，固化30-60 min，无菌水洗涤三次，得单层湿微胶囊；

（5）双层微胶囊制备：将所得单层湿微胶囊与用无菌处理的0.5-5%壳聚糖中覆膜30-60 min，无菌水洗涤三次，得双层湿微胶囊；

（6）干燥保藏：将双层湿微胶囊进行低温真空干燥后在无菌条件下进行真空包装，得枯草杆菌干微胶囊。

述枯草杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于，对步骤（5）中所述双层湿微胶囊进行低温真空干燥为40 ^oC以下的任何一种干燥方式，并真空包装。

所述枯草杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的枯草杆菌菌株指的是野生型枯草杆菌、基因工程的枯草杆菌中的一种或两种。