[发明专利]一种利用微生物发酵生产4-乙基愈创木酚的方法

说明书

（一）        技术领域

    本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种利用微生物发酵生产4-乙基愈创木酚的方法。

（二）        背景技术

4-乙基愈创木酚（4-Ethylguaiacol，简称4-EG）又名2-甲氧基-4-乙基苯酚，分子式为C₉H₁₂O₂，分子量为152.19Da，密度为1.067×10³kg/m³，熔点为15℃，沸点为234-236℃。4-EG为无色至淡黄色的油状液体，具有温暖的辛香口味，属酱香型香料，是酱油的主要香味成分，也是酱香型白酒的一种重要风味物质，它不仅赋予产品特定的风格和口感，而且具有清除自由基的功能，可抗衰老及预防众多疾病的发生。目前4-乙基愈创木酚已广泛应用于酱油、酒类、饮料、食品、香精、饲料等行业以及医药、香料和染料等产品的合成，具有广阔的市场前景。

4-乙基愈创木酚的生产方法有植物提取法和化学合成法。植物提取法是从各种含有4-EG的植物中提取得到，如中国专利文献CN 102659534A（申请号201210105766.7）公开了一种从稻草生物油中提取4-乙基愈创木酚的方法，具体步骤如下：1）将稻草生物油碱洗，过滤，取滤液备用；2）在滤液中加入酸，进行酸化处理；3）采用有机溶剂萃取，得到油相产物；4）油相产物经减压蒸馏，除去有机溶剂，得到粗产品；5）粗产品减压蒸馏，得到4-乙基愈创木酚。但由于植物中的4-EG含量较低，导致提取工艺成本较高而难以实现大规模生产。

化学合成法是生产4-EG的常用方法，如陈恩治（香料香精化妆品，2010.3）在进行4-乙基愈创木酚的合成研究时，以香荚兰乙酮为原料，采用改良的还原法合成了4-乙基愈创木酚，得率为72%。如中国专利文献CN 1631862A（申请号200310122614.9）公开了一种4-乙基愈创木酚的合成方法，其工艺包括以固体酸为催化剂，在加热、加酸条件下，由愈创木酚和乙烯反应制得4-乙基愈创木酚，反应温度为30-200℃，反应压力为20-100kg/cm³，催化剂的用量为愈创木酚重量的1-10％重量百分数，反应产物经提取后精馏得产品。但化学合成法普遍存在较严峻的环保问题，反应条件一般较剧烈，对生产设备要求较高，生产工艺复杂，产品收率低；并且由于产品中含有原料、副产物、溶剂等物质的残留物，因此该方法得到的4-EG不能直接应用到食品中。

随着人们对绿色产品要求的日益提高，利用生物工程技术生产4-EG的方法具有产品绿色天然、安全可靠、反应条件温和、环境污染小等优点而受到人们的重视。与植物提取法和化学合成法相比，生物技术法具有原料来源广泛、副产物少、产品收率高、生产成本低、易于实现工业化的特点，是一种经济有效和极有产业化前景的4-乙基愈创木酚生产方法。

生物技术法是通过培养微生物细胞生产4-EG的方法。许多微生物能够利用培养基中的营养物质产生4-乙基愈创木酚，但由于这些微生物细胞内的相关酶活性较低，产生的4-EG含量较低（一般在2.0-5.0mg/L），因而不能满足工业化生产的要求。

（三）        发明内容

    本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种产率高、成本低、可规模化生产的利用微生物发酵生产4-乙基愈创木酚的方法。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种利用微生物发酵生产4-乙基愈创木酚的方法，以菌种保藏编号为CGMCC No.8044的环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）HG12菌株为生产菌种，包括如下步骤：

（1）将环状芽孢杆菌HG12菌株的液体种子按体积比为3-5%的接种量接种到液体发酵培养基中，在37-40℃、160-200r/min下，发酵36-60h，制得发酵液，将发酵液用微孔滤膜过滤，收集滤出液，调pH值为5.0-6.0，制得含有4-乙烯基愈创木酚的滤出液；

（2）向滤出液中接种体积比为5-10%接种量的酒香酵母菌株的液体种子，在28-30℃下，发酵12-36h，制得含有4-乙基愈创木酚的发酵液；

（3）将发酵液用微孔滤膜过滤，收集滤出液，向滤出液中加入萃取剂，混合均匀，静置分相，制得含有4-乙基愈创木酚的萃取液，将萃取液真空蒸发，制得4-乙基愈创木酚。