[发明专利]一种艾滋病（HIV-1）高精确核酸定量检测的方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学临床诊断领域中的一种艾滋病（HIV-1）高精确核酸定量检测的方法及其试剂盒。

背景技术

人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus,HIV）是导致一种慢性致死性疾病艾滋病（Acquired immune defiiency syndrome,AIDS）的病原微生物。由于艾滋病具有传染性和高致死性，因此已经成为世界范围内重点防控的主要疾病之一。自第一例艾滋病病例于1981首次报告艾滋病病例以来，到目前为止，艾滋病已造成超过两千五百万人死亡。中国自1985年首次发现艾滋病病例以来，艾滋病的流行呈快速爬升倾向。近年来，中国艾滋病的感染与发病人数也增长较快。中国艾滋病现状，据联合国驻华机构显示的数据，目前中国艾滋病病毒感染者约84万人，加上已经过世的24万人，总数应在100万人左右。根据世界卫生组织预测，目前虽然中国艾滋病病毒携带者占总人口的比例虽然很低，但感染总人数在亚洲位居第2位，在全球居第14位。鉴于中国是世界人口基数最大，人口最为密集的国家，一旦艾滋病大规模流行将成为一场公共卫生灾难。

HIV的诊断目前常用的诊断手段包括病毒学诊断和血清学诊断，HIV感染的病毒学诊断技术常用方法为共培养法，即用正常人外周血液分离单个核细胞，加PHA刺激并培养后，加入病人单个核细胞进行艾滋病的诊断。血清学检测中，酶联免疫法是目前诊断艾滋病的一个主要手段。HIV酶联免疫试剂目前已经普遍用于临床，急诊，血液筛查等各个领域。但是，酶联免疫方法作为一种间接滞后的检测方法，他所检测的目标是人体内产生的抗体而不是病原体本身。因此，虽然酶联免疫方法经过几代的改良和进化，在灵敏度、特异性、精确度和稳定性等方面有了巨大的提高。近年来核酸分子检测技术在检验医学和临床研究中显示出强大的优势，相比较酶联免疫诊断技术具有灵敏度高、特异性强、诊断快速等优点。血清中的HIV RNA是病毒复制和艾滋病进程的确切标志，所以血清中HIV RNA的检测，已成为诊断艾滋病的“金标准”方法。近几年来，通过荧光定量PCR方法直接检测HIV RNA已经成为一种通用艾滋病医学检测方法，大大提高了艾滋病的检测准确性，有利于疾病的早期诊断，可将“窗口期”大大的缩短。在艾滋病预防过程中，艾滋病高危人群的诊断是“防艾”的关键环节，而核酸诊断试剂在确诊艾滋病病毒携带者的过程中发挥了重要作用，目前，已经成为艾滋病确诊的金标准试剂。艾滋病核酸定量检测目前已经是通过国家认证临床PCR实验室的常规检测项目之一。在艾滋病患者确诊，用药和疗效预判，以及康复治疗过程中具有指导意义。同时，艾滋病病毒载量的精确判读，也为患者提供了准确的病情控制信息。

HIV为逆转录病毒科慢病毒亚科，HIV有十分高的遗传变异率，高度变异区在env基因内，变异率为20%-30%。gag和pol基因虽然较少变异，但是也存在一定概率变异，分别为gag1基因约5%-22%，pol基因为15%。所以，对于HIV核酸检测试剂来说，所用扩增引物的保守性和基因型覆盖能力，以及检测不同基因型样品的灵敏度是否一致，一直是评价此类诊断试剂产品性能的重要指标之一。也是困扰当今HIV诊断试剂向国际化发展的技术壁垒之一。

近年来，相比于传统的病毒核酸提取技术，市场上涌现了一些简单方便的离心柱法病毒核酸提取技术，由于提取技术中的离心柱配套使用的高通量自动化离心设备成本过高，难于普及推广。因此，研究开发一种艾滋病（HIV-1）高精确核酸定量检测的方法及其试剂盒是目前急待解决的新课题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种艾滋病（HIV-1）高精确核酸定量检测的方法及其试剂盒，该发明从根本上解决现有HIV-1核酸定量PCR技术存在的基因型覆盖不全、漏检率高、灵敏度低、准确性差等问题，其设计的引物和TaqMan荧光探针位于HIV基因组的5’LTR区域，该引物和探针具有基因型覆盖范围广，检测灵敏度高，特异性强、稳定性好等优点。同时应用磁珠法进行RNA提取，方法简单，核酸纯度高，提取样本可为血清或血浆，样本量大，采用内标和防污染体系提高检测精确度，采用耐DNase和RNase假病毒作为工作标准品和质控品，提高试剂盒的稳定性。