[发明专利]用于检测菊黄东方鲀生长速度的引物对、试剂盒及方法

说明书

[技术领域]

本发明涉及菊黄东方鲀的检测引物和方法，具体涉及用于检测菊黄东方鲀生长速度的引物对、试剂盒及方法。

[背景技术]

菊黄东方鲀（Fugu flavidus）俗称艇巴、乖鱼、菊黄、满天星等,分类上隶属鲀形目(Tetraodontif-ormes)鲀科(Tetraodontidae)东方鲀属(Fugu)，主要分布于我国黄海、东海和渤海。由于其味道鲜美，营养丰富，颇受欢迎，是一种名贵的养殖种类。在养殖过程中，养殖环境规范化程度越来越高，生长速度快的个体可以缩短养殖时间，提高饲料的利用率，节约养殖成本，因此培育筛选生长速度快菊黄东方鲀是水产养殖者追求的目标。

肌肉生长抑制因子（Myostatin,MSTN）最先从小鼠骨骼肌cDNA文库克隆到，它主要在肌肉组织中大量表达，属于TGF-β超级家族。对MSTN基因敲除小鼠地研究表明，突变小鼠的体重比杂合体和野生型小鼠体重增加约30%，其中肌细胞增生（hyperplasia）和肌纤维肥大（hypertrophy）双重作用所造成的肌肉肥大是造成体重增加的主要原因，并且这一特性与动物的性别及年龄无关，而且不影响动物的繁殖能力。因此，MSTN是肌肉生长的一个重要负调控主效基因。活化的MSTN与细胞膜表面受体（活化素受体蛋白II B（ACVR2B）和活化素受体蛋白IB（ACVRB））相结合，可以激活下游的S妈的2/3和p38MAPK细胞内信号传导途径，从而调节各组织的生长发育。

在《黄颡鱼MSTN基因多肽性及其与生长性状的相关分析》（朱媛媛等，遗传，2012年1月34（1）：72-78页）一文中，披露了MSTN对黄颡鱼生长速度的影响，通过转基因技术和DNAi技术抑制斑马鱼的MSTN基因发现实验鱼的肌肉明显比正常鱼发达，因此认为该基因在动物肌肉生长发育中起到重要抑制作用，也可能参与脂肪的生成和调节。在鱼类中，MSTN mDNA可以在肌肉，眼，脑、肠、腮、肾、心、脾中发现，并且在不同的鱼种中MSTN还分为两类，MSTN1、MSTN2（牙鲆肌肉生长抑制素基因克隆，徐建勇、陈松林，水产学报第32卷第4期，2008年7月，497-498）。

[发明内容]

菊黄东方鲀中存在基因加倍现象，这些加倍基因存在着多个拷贝，MSTN2（为肌肉生长抑制因子）在菊黄东方鲀中存在多个拷贝，PCR会扩增一些无意的拷贝，如碱基序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示，该片段位于菊黄东方鲀MSTN2基因3端非翻译区域，其中就出现了重复段GT，这些拷贝的存在，影响了对结果的分析。

在上述发现的基础上，为了解决现有技术中PC扩增拷贝对于结果带来干扰的问题，并且弥补现有技术中对于菊黄东方鲀生长速度研究的空白。本发明首先提供一种用于检测菊黄东方鲀的引物对，引物对由：碱基序列为SEQ ID NO：3的上游引物和SEQ ID NO：4的下游引物组成。

该引物对还可以用于制作试剂盒，除了上述引物对外，试剂盒内还包括生长速度快的菊黄东方鲀标记MARKER。

用上述试剂盒检测菊黄东方鲀生长速度的方法如下：

提取样品菊黄东方鲀的肌肉生长抑制因子的DNA序列，

利用试剂盒中的引物对将样品菊黄东方鲀的DNA进行PCR扩增；

将扩增产物进行PAGE处理，

观察条带大小，与MARKER条带大小一致的为生长速度快的个体。

进一步的，上述方法还具有如下优化方案：

所述的PCR扩增反应体系20μL，包括2uL10×PCR缓冲液，0.8ul10mmol/L的dNTP mix,0.4μmol/L的上游引物，0.4μmol/L的下游引物，30ng的样品菊黄东方鲀DNA。

所述的PCR扩增反应条件优选为，94℃下变性3分钟，94℃下变性30秒，64℃下复性30秒，及72℃下延伸30秒，共42个循环，最后72℃延伸10min。

所述的PAGE的步骤优选为：

取等量的变性上样缓冲液分别加入PCR产物及试剂盒中MARKER中，99℃变性10分钟，在尿素变性PAGE（6%）中进行电泳至溴酚蓝跑出PAGE，进行银染，固定，染色及显色。

通过本发明的引物对、试剂盒及方法来鉴别菊黄东方鲀的生长速度，具有可重复性高，准确性强，简便快速的优点。该引物对在生长速度快群体中占有非常高比例，并且与最小人工选育亲本的契合度高达96%以上。

[附图说明]

图1为本发明的菊黄东方鲀MSTN2基因中的SNPs位点示意图；