[发明专利]利那洛肽的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及利那洛肽的制备方法。

背景技术

利那洛肽是在成年中治疗便秘肠易激综合征(IBS-C)和慢性特发性便秘(CIC)的药物(鸟苷酸环化酶－C(GC-C)的激动剂)。利那洛肽与肠道GC-C结合后，导致细胞内外环鸟苷酸（cGMP）浓度升高。细胞内cGMP升高可以刺激肠液分泌，加快胃肠道移行，从而增加排便频率。细胞外cGMP浓度升高可以降低痛觉神经的灵敏度，可减低肠道疼痛。此外，利那洛肽也可用于治疗和预防结肠癌、直肠癌和机体炎症。利那洛肽序列为SEQ ID NO：1所示的序列：CysCysGluTyrCysCysAsnProAlaCysThrGlyCysTyr。在1位和6位、2位和10位以及5位和13位的半胱氨酸残基之间通过氧化形成二硫键成环，到目前为止，利那洛肽及其相关肽的合成制备仅得到10-25%的产物，例如文献Optimized Fmoc Solid-Phase Synthesis of the Cysteine-Rich Pertide Linaclotide,Published online4August2010in Wiley Online Library,报道的制备方法。中国专利公开号CN102875655A，其氧化步骤进一步简化，产率也有所提高，但是其收率仍然不理想，环化过程复杂且环化产率低，需要消耗大量的溶剂和原料，且需要大量的时间分离提纯，给工业化生产带来不便。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种利那洛肽的制备方法，简化环化过程，提升环化产率，使产品收率提高。

本发明的技术方案是：具有如下结构的利那洛肽的制备方法，

其特征在于：包括如下步骤：

（1）采用固相Fmoc技术，将羧基树脂和侧连带有保护基的Fmoc酪氨酸置于反应瓶中，加入有机碱和偶合剂，在DMF溶液中反应后，脱除Fmoc保护基团，得到与侧连带有保护基的酪氨酸偶联的树脂；

（2）将步骤（1）得到的与侧连带有保护基的酪氨酸偶联的树脂直接和侧连带有保护基的Fmoc半胱氨酸置于反应瓶中，加入有机碱及偶合剂，在DMF溶液中反应后,脱除Fmoc保护基团，得到进一步与侧连带有保护基的半胱氨酸偶联的树脂；

（3）依次重复步骤（2），其中原料氨基酸依次替换为Fmoc甘氨酸、侧连带有保护基的Fmoc苏氨酸、侧连带有保护基的Fmoc半胱氨酸、Fmoc丙氨酸、Fmoc脯氨酸、侧连带有保护基的Fmoc天冬酰胺、侧连带有保护基的Fmoc半胱氨酸、侧连带有保护基的Fmoc半胱氨酸、侧连带有保护基的Fmoc苏氨酸、侧连带有保护基的Fmoc谷氨酸、侧连带有保护基的Fmoc半胱氨酸、侧连带有保护基的Fmoc半胱氨酸，最终得到脱除Fmoc保护基团的与上述氨基酸依次偶联的树脂；

（4）切割步骤（3）所得与上述氨基酸依次偶联的树脂，得到化合物：

HO-Tyr-Cys-Gly-Thr-Cys-Ala-Pro-Asn-Cys-Cys–Tyr-Glu-Cys-Cys-H；

（5）将步骤（4）所得化合物用单质碘在pH=6-13的磷酸钠缓冲溶液中氧化,形成三个二硫键得到利那洛肽产品：

根据本发明提供的利那洛肽的制备方法，优选的是，所述侧连带有保护基的Fmoc酪氨酸、侧连带有保护基的Fmoc半胱氨酸、侧连带有保护基的Fmoc苏氨酸、侧连带有保护基的Fmoc天冬酰胺、侧连带有保护基的Fmoc谷氨酸依次为叔丁基保护的Fmoc酪氨酸、三苯甲基保护的Fmoc半胱氨酸、Trt保护的Fmoc苏氨酸、Trt保护的Fmoc天冬酰胺、tBu保护的Fmoc谷氨酸。

本发明所述的利那洛肽的制备方法的切割过程中，同时去掉氨基酸的侧连保护基团。

根据本发明提供的利那洛肽的制备方法，进一步优选的是，所述步骤（5）中磷酸钠缓冲溶液pH=9-12。

根据本发明提供的利那洛肽的制备方法，优选的是，所述羧基树脂为王树脂。

根据本发明提供的利那洛肽的制备方法，优选的是，所述有机碱为二异丙基乙基氨。

根据本发明提供的利那洛肽的制备方法，优选的是，所述偶合剂为苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐。

根据本发明提供的利那洛肽的制备方法，优选的是，所述各种侧连带有保护基的Fmoc氨基酸与羧基树脂的摩尔比均为2～8/1。

根据本发明提供的利那洛肽的制备方法，优选的是，所述偶合剂与羧基树脂摩尔比2～8/1。