[发明专利]一种检测甘蔗赤条病菌的荧光定量PCR试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测植物病菌的PCR试剂盒，具体涉及一种检测甘蔗赤条病菌的荧光定量PCR试剂盒，属微生物检测领域。

背景技术

甘蔗赤条病（Sugarcane red stripe disease）是一种普遍发生的细菌性病害，几乎在主要甘蔗种植国家均有发生，我国甘蔗赤条病在几个种植甘蔗的省（区）都有零星发生。甘蔗赤条病菌被认为是红条纹假单胞菌Pseudomonas rubrilineans （Lee et al.） Stapp引起，其形态特征为无芽孢，呈杆状，大小为0.7 × 1.6 μm，有单根极生鞭毛，有薄荚膜，革兰氏染色反应为阴性。1992年Willems等将红条纹假单胞菌重新命名为燕麦噬酸菌燕麦亚种（Acidovorax avenae subsp. Avenae）。Zia-ul-Hussnain等（2011）从巴基斯坦甘蔗赤条病株上分离得到了燕麦噬酸菌燕麦亚种病菌，并对该病菌的菌体形态、培养性状、生理生化反应作了研究。燕麦噬酸菌燕麦亚种病菌其寄主范围除甘蔗外，还有水稻、玉米、铺地黍等禾本科的一些植物。病害有叶条斑和顶腐两种类型。两者可以单独发生，亦可并发。在潮湿温暖的条件下容易发病，而且病叶的伤痕表面常有细菌溢泌物，借助雨水和气流传播。患病的枯老蔗叶、病茎中的病原菌经4个月后仍然有致病力。因此建立甘蔗赤条病菌的快速、准确、灵敏的检测技术，对该病的防治起到十分关键的作用。

常用的检测病菌的方法有生物学鉴定法、电镜技术、酶联免疫技术和分子生物学技术等。生物学鉴定法耗时、且步骤繁琐；电镜技术需要植物组织切片，步骤繁琐，且只能通过形态学观察判断；酶联免疫技术需要特异性的抗血清，且灵敏度不及分子检测技术；基于PCR原理的分子生物学技术是一种灵敏度高、特异性强的快速检测技术，在其它甘蔗病原物的检测已得到广泛应用。目前，检测甘蔗赤条病菌燕麦噬酸菌燕麦亚种的荧光定量PCR试剂盒及其方法未见报道。

本发明在分离获得甘蔗赤条病菌，克隆测序病菌基因组核糖体rDNA序列基础上，选择甘蔗赤条病菌16S-23S rDNA间隔区序列（ITS），设计用于荧光定量PCR检测的引物及探针，通过对反应体系的优化，研制用于检测甘蔗赤条病菌的荧光定量PCR试剂盒及方法，为我国甘蔗科研、检疫、质检等部门提供快速、灵敏、准确的病害检测试剂盒产品和技术服务。

  

发明内容

本发明目的是提供一种检测甘蔗赤条病菌的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒能快速准确的对待测样品的甘蔗赤条病菌进行定量检测。该试剂盒不仅可使用于目前市场上的所有类型荧光定量PCR仪，而且能够灵敏、特异的对甘蔗赤条病菌进行定量检测。

为了实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：

本发明采用Taqman探针建立荧光定量PCR检测甘蔗赤条病菌试剂盒，通过制备病菌DNA标准样品与待测样品同时检测，得到待测样品的初始病菌拷贝数，对病菌进行定量检测。

本发明提供了一种利用荧光定量PCR方法检测甘蔗赤条病菌的引物对QPCR-F5、QPCR-R5和Taqman探针QPCR-P5，所述的引物对序列如下：

QPCR-F5：5’-TCATCCTCCACCAACCAATA-3’，

QPCR-R5：5’-TACCGGACCAACAACAAAGA-3’；

Taqman探针QPCR-P5的序列如下：

5’-FAM-CACCAAAGCGGCTTCGCAAG-TAMRA-3’。

本发明还提供一种检测甘蔗赤条病菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于该试剂盒由下列试剂组成：

（1）阳性标准品：采用常规PCR扩增含有16S-23S rDNA间隔区的DNA作为标准样品，1×10¹⁰拷贝/μL，50 μL/瓶，-20℃冷冻保存；

（2）阴性对照：采用无甘蔗赤条病菌感染的甘蔗叶片组织，提取叶片总DNA为阴性对照，100 ng/μL，50 μL/瓶，-20 ℃冷冻保存备用；

（3）PCR反应液：每个反应包括5×PCR缓冲液5.0 μL、10 mmol dNTPs 0.5 μL、25 mmol MgCl₂ 2.0 μL以及浓度为10 μmol/L的引物对 QPCR-F5和QPCR-R5各2.0 μL，共11.5 μL，50个反应体系共计575 μL，-20 ℃保存备用；