[发明专利]一种检测牛PNPLA3基因单核苷酸多态性的方法与应用

权利要求书

1.一种快速检测秦川牛PNPLA3基因SNP的RFLP方法，其特征在于：以包含PNPLA3基因的待测牛基因组DNA为模板，以引物对P1、P2、P3、P4、P5为引物，PCR扩增秦川牛PNPLA3基因，PCR产物经测序，共发现27个多态位点；从中挑选错义突变位点4个，并针对这4个SNP位点设计引物对P2-BglI、P2-RsaI、P3-BmgT120I和P3-MspI，进行PCR扩增待测牛的PNPLA3基因片段，用限制性内切酶BglI、RsaI、BmgT120I和MspI分别酶切对应引物对P2-BglI、P2-RsaI、P3-BmgT120I和P3-MspI的PCR扩增产物，再用琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定秦川牛PNPLA3基因第2062位、第2078位、第35800位和第35932位的单核苷酸多态性；

所述的引物对P1为：

上游引物：5'-CTTCACAAGCCAGACCCT-3'

下游引物：5'-GCTGTATGATAGCCCCTA-3’

所述的引物对P2为：

上游引物：5'-GACCATTTCTCGTTACCA-3'

下游引物：5'-AGGATGAAGACCCCACTG-3’

所述的引物对P3为：

上游引物：5'-GCATGTGGCAGTCCTGAG-3'

下游引物：5'-TGTTGCTGTTGGTCCGTC-3’

所述的引物对P4为：

上游引物：5'-TTTGTCACGAGCGGAATG-3'

下游引物：5'-GGAAAGGAGACAGAGCAA-3’

所述的引物对P5为：

上游引物：5'-ATTCCTTCCCTGCTGACT-3'

下游引物：5'-AAACCTGAGGGAGCAATG-3’

所述的引物对P2-BglI为：

上游引物F1：5'-CTCCTGGATGACATTTGGGGGCCGT-3'

下游引物R1：5'-TCTGTGCCTGGAGGCTGACATGAAG-3’

所述的引物对P2-RsaI为：

上游引物F1：5'-CTCCTGGATGACATTTGGGGGCCGT-3'

下游引物R1：5'-TCTGTGCCTGGAGGCTGACATGAAG-3’

所述的引物对P3-BmgT120I为：

上游引物F2：5'-CTCTATCCCTAATCTGAAGCA-3'

下游引物R2：5'-ACCTTGACATCTGGTGGG-3’

所述的引物对P3-MspI为：

上游引物F2：5'-CTCTATCCCTAATCTGAAGCA-3'

下游引物R2：5'-ACCTTGACATCTGGTGGG-3’。

2.根据权利要求1所述的快速检测秦川牛PNPLA3基因SNP的RFLP方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应程序为：

引物对P2-BglI：

95℃预变性5min；34个循环95℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸20s；72℃延伸10min；

引物对P2-RsaI：

95℃预变性5min；34个循环95℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸20s；72℃延伸10min；

引物对P3-BmgT120I：

95℃预变性5min；34个循环95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸20s；72℃延伸10min；

引物对P3-MspI：

95℃预变性5min；34个循环95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸20s；72℃延伸10min。

3.根据权利要求1所述的快速检测秦川牛PNPLA3基因SNP的RFLP方法，其特征在于，所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为3.0％，以120V电泳1.25个小时。