[发明专利]血液中循环癌细胞的检测信号放大的方法与试剂盒

说明书

本发明提供了一种信号放大检测血液中循环癌细胞的试剂盒和方法、以及人乳腺癌细胞的检测试剂盒，所述信号放大检测血液中循环癌细胞的试剂盒包括有：偶联循环癌细胞上抗原的特异性抗体1的探针A；偶联循环癌细胞上抗原的特异性抗体2的探针B;c）连接探针A和探针B的连接子。该试剂盒基于连接酶激活型探针，通过对CTCs的检测信号放大，可实现对血液中循环癌细胞的高灵敏度和高特异性的检测。

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体是涉及一种血液中循环癌细胞的检测信号放大的方法与试剂盒。

背景技术

肿瘤转移是导致肿瘤复发和难以根治的重要原因。而肿瘤的微转移（micrometastasis）是指少数具有转移潜能的肿瘤细胞脱离原发灶，转移到血液、淋巴结、骨髓或远处器官中。目前临床的检测手段很难发现这种微转移。相关研究表明，在癌症发展的早期，已有微转移发生。循环癌细胞（circulating tumor cells，CTCs）是自发或因诊疗操作，由实体瘤或转移病灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞，是恶性肿瘤患者出现术后复发或远处转移的重要标志。CTCs的早期检测有助于早期发现肿瘤的微转移、监测术后复发、评估疗效及预后或选择合适的个体化治疗。

目前CTCs检测的主要方法有传统细胞学方法，聚合酶链反应（PCR），流式细胞分选（fluorescence-activated cell scanning/sorting,FACS），免疫磁性分离（magnetic-activated cell separation,MACS），稀有细胞自动检测系统，以及基于表面拉曼增强（SERS）和量子点的新方法。

传统的免疫细胞化学检验方法CTCs是目前公认的标准方法。但由于CTCs在外周血中的数量常小于1/10⁶，如果通过常规的细胞涂片方法，理论上，每份标本将需要制备1000张涂片才可能检测到CTCs。而通过反转录-PCR方法检测癌变组织特异性标志的mRNA来间接确定血液中的CTC的存在。由于实验污染，非常规转录，采血过程中其它来源细胞的污染，以及PCR本身的特点决定该方法的假阳性非常高^[12]。因此在进行检测前对CTCs进行快速有效富集是该技术的关健。目前的细胞富集方法主要有基于流式细胞术和免疫磁性分离技术。流式细胞术筛选细胞的速度为10³-10⁴/秒，CTCs在外周血中的数量稀少，为提高阳性率长需要检测10⁷-10⁸个单个核细胞，这样一次筛选需要几小时，速度慢，试剂消耗也非常大，难以常规应用。而免疫磁性分离的细胞筛选速度可以达到10⁶-10⁷/秒，适合大量细胞的筛选，富集后的细胞可以在一张载玻片上进行免疫细胞化学分析，也可以进行流式检测。此方法比单纯采用RT-PCR或免疫组化法敏感性高10-100倍，从而减少了假阳性和假阴性。荧光显微镜为基础的稀有细胞自动检测系统其主要的特点是能够快速的分析大量的显微镜视野，并将信息以数字模式储存图像，通过坐标系统记录靶细胞在载玻片上的位置，进一步通过普通光学显微镜分析细胞的形态。通过此系统检测外周血单个核细胞中CTCs阳性的灵敏度和特异性都非常高。

CTCs的出现可能发生在肿瘤发生及转移的早期，因此它的检出有可能成为一种比目前常规的肿瘤诊断方法（病理学，影像学和血清学）更早的肿瘤诊断手段。但是由于CTCs在外周血中的数量极少，而且容易与白细胞混淆，目前的检测的方法还很难达到临床的标准。因此急需发展一种能够灵敏，准确，快速的检测CTCs的新方法。