[发明专利]用ISSR分子标记法对甘薯品种真实性进行鉴别的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用ISSR分子标记法对甘薯品种真实性进行鉴别的方法。

背景技术

甘薯是一种重要的粮食、饲料、工业原料和能源作物。近些年，随着全球石油供给形势的日益严重，生物质能源的开发和利用日益重要。甘薯单位面积淀粉产量高，被认为是生产燃料乙醇的理想原料。甘薯作为新型的能源用植物，其市场潜力巨大，它将在我国能源安全中扮演重要的角色。

甘薯种薯的真实性和纯度是衡量种薯质量的重要指标，直接影响甘薯的产量和品质。生产上如何快速、准确鉴定甘薯种薯真实性是一个突出的问题。传统的形态鉴定法依赖于品种表型差异，而形态性状的表现受环境影响较大，稳定性差，误鉴率较高。

分子标记技术具有丰富的多态性和环境稳定性，且操作简便，已开始广泛应用于作物品种鉴定与纯度检测中。ISSR分子标记是在SSR标记基础上发展起来的一种新技术,其基本原理是在SSR的5’或3’端加锚1-4个嘌呤或嘧啶碱基，然后以此为引物，对两侧具有反向排列SSR的一段基因组DNA序列进行扩增。ISSR兼具SSR、RAPD、RFLP、AFLP等分子标记的优点，与SSR相比，ISSR不需要预先获知序列信息而使成本降低，且多态性更丰富；与RAPD相比，ISSR重复性高，稳定性好，同时具备RAPD的简便、易操作等特点。目前，ISSR标记技术在植物种质资源遗传多样性和亲缘关系、基因定位、分子标记辅助选择等研究中已广泛的应用。在甘薯中，应用ISSR分子标记分析甘薯种质资源遗传多样性已有报道，但应用ISSR分子标记技术进行甘薯品种真实性鉴定的方法尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种用ISSR分子标记法对甘薯品种真实性进行快速鉴别的方法。

本发明提供的一种用于辅助鉴定甘薯种薯真实性的引物组，由HBAAS-001引物、HBAAS-815引物和HBAAS-825引物组成；

HBAAS-001引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

HBAAS-815引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

HBAAS-825引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

一种用于辅助鉴定甘薯种薯真实性的试剂盒也属于本发明的保护范围，该试剂盒由上述引物组、PCR扩增缓冲液，dNTP，DNA聚合酶和ddH₂O组成。

一种指纹图谱也属于本发明的保护范围，分别以所述引物组的三条引物对16种甘薯品种的叶片的DNA分别进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，得到每条引物针对每个甘薯品种的谱带，即为所述引物HBAAS-001对16种甘薯品种构建的指纹图谱、引物HBAAS-815对16种甘薯品种构建的指纹图谱和引物HBAAS-825对16种甘薯品种构建的指纹图谱；

所述16种甘薯品种为广薯菜2号、商薯19、尚志12、徐紫薯1号、鲁薯3号、徐薯26、徐薯43-14、苏薯10号、苏薯3号、苏薯11号、徐薯55-2、徐紫8008、莆薯53、台农71、徐22-5和台农66；

所述PCR的体系如下：

模板DNA1μL，浓度为10μM的引物2μL，10×PCR扩增缓冲液5μL，浓度为2.5mM的dNTPs4μL，DNA聚合酶0.5μL，dd H₂O补充体系至50μL；

DNA聚合酶的商品名称为Easy Taq DNA Polymerase，购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为AP111；

所述模板DNA为下述16种甘薯品种的叶片的DNA：广薯菜2号、商薯19、尚志12、徐紫薯1号、鲁薯3号、徐薯26、徐薯43-14、苏薯10号、苏薯3号、苏薯11号、徐薯55-2、徐紫8008、莆薯53、台农71、徐22-5和台农66；

所述引物分别为所述引物组的三种引物；

所述PCR的程序如下：

94℃变性5min；94℃变性30s，60℃复性1min，72℃延伸3min，共40个循环；72℃延伸10min，10℃保存；

所述16种甘薯品种为广薯菜2号、商薯19、尚志12、徐紫薯1号、鲁薯3号、徐薯26、徐薯43-14、苏薯10号、苏薯3号、苏薯11号、徐薯55-2、徐紫8008、莆薯53、台农71、徐22-5和台农66；

所述琼脂糖凝胶的浓度为4%，琼脂糖与电泳缓冲液的比例为4g：100ml。