[发明专利]猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体竞争 AlphaLISA检测试剂盒及其方法

说明书

技术领域

本发明涉及猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的免疫学检测，具体涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体竞争AlphaLISA检测试剂盒及其方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是引起猪繁殖与呼吸综合征病（PRRS）的主要病原。该病主要引起怀孕母猪流产、早产、死胎和木乃伊胎等繁殖障碍，仔猪和育肥猪呼吸道症状，感染猪免疫抑制和亚临床感染，并对其它致病因子的易感性增加。自1987年美国首次报道了猪繁殖与呼吸综合征以来，该病呈世界性流行，给养猪业造成巨大损失。我国自1996年首次分离到该病毒以来，已先后在广东、上海、福建等省暴发和流行，目前该病在我国已普遍存在。现有的检测方法主要有病毒的分离鉴定、免疫过氧化物酶技术，免疫胶体金技术，免疫荧光抗体染色技术，核酸探针杂交技术（ISH），ELISA、PCR和real time PCR等，各有优缺，且特异性差异较大。同时，方法对样品和人员的要求较高。由于猪感染猪繁殖与呼吸综合征病毒或免疫猪繁殖与呼吸综合征疫苗均能产生相应的抗体，且抗体能较好的反应其免疫或感染病毒的情况，因此，可以通过检测PRRSV 的抗体来反应其免疫感染病毒情况。

AlphaLISA技术主要依赖于Alpha供体微珠和受体微珠的相互作用。当生物反应使供体微珠和受体微珠相互接近时, 激光激发级联反应，从而产生极大放大的信号。具体来说，在680nm 的激光照射下, 供体微珠上的光敏剂将周围环境中的氧气转化为更为活跃的单体氧。单体氧扩散至受体微珠，产生一系列的化学发光反应，最后将能量传递到铕，发射波长为615nm。在生物分子不存在特异的互相作用时，单体氧无法扩散到受体微珠，则不会有信号的产生。AlphaLISA技术凭借一种专有的基于微珠的技术，将传统的ELISA 转化为均相的“无需洗涤”的检测。

AlphaLISA技术所使用的稀土元素铕（Eu），发射波长非常尖锐，为615nm，从而大大减少了检测样品中杂质的干扰，可直接检测复杂样品（血清和体液）中的生物分子。在临床上，这非常适合测定人和动物的血清和体液样本。而此技术的高通量、高灵敏度、操作简便，能更准确、更省时的测定细胞因子等生物标志物。目前，已广泛用于药物筛选、细胞因子、病变基因、血清抗体等的检测。

中国发明专利（申请号为：201210031802.X、201210047016.9）分别公开了采用AlphaLISA技术检测肠道病毒71型衣壳蛋白（Anti-EV71 VP1 IgM）和甲型肝炎病 IgM 的方法。但是，目前尚无利用AlphaLISA技术检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的试剂盒及检测方法的报道。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体竞争AlphaLISA检测用试剂盒，第二目的是提供一种用于食品安全检测的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体竞争AlphaLISA检测方法。

猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体竞争AlphaLISA检测试剂盒，包括供体微珠、受体微珠、猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白单克隆抗体及带His标签的N蛋白抗原。

其中，所述供体微珠为螯合镍的供体微珠，PE,AS101D（即Nickel chelate Donor beads(PE,AS101D)），浓度为80μg/mL，500μL；所述受体微珠为抗鼠IgG受体微珠，PE,AL105C（即Anti-mouse IgG Acceptor beads(PE,AL105C)），浓度为80μg/mL，500μL。

所述带His标签的N蛋白抗原的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

所述猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白单克隆抗体是针对猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的特异性抗体。

前述试剂盒，包括供体微珠80μg/mL、受体微珠80μg/mL、猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白单克隆抗体100nM/L及带His标签的N蛋白抗原180nM/L。使用时，以总体系20μL计，每孔添加量为：80μg/mL受体微珠3μL、80μg/mL供体微珠5μL、180nM/L带His标签的N蛋白抗原 5μL、100nM/L猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白单克隆抗体 5μL及待测样本2μL。待测样本可以是血清、体液等。

具体地，编码前述带His标签的N蛋白抗原的基因为PRRSV N基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2。