[发明专利]一种双层平板及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于浸矿微生物筛选的产品技术领域，具体涉及一种用于浸矿微生物筛选的双层平板及其制备方法，和菌株。 

背景技术

生物冶金利用微生物氧化硫化矿等矿物中的铁和硫，使结合在矿石中的有价金属释放到溶液中以利于进一步提取。浸矿微生物主要包括自养的铁氧化菌和硫氧化菌，它们利用硫化矿中的Fe^2＋或者还原型的硫化物（如黄铁矿Fe₂S）作为能源生长，产生硫酸促进硫化矿的浸出，因此，筛选出高效浸矿微生物是生物冶金的关键。 

固体培养基通常用于浸矿微生物的分离和培养,然而浸矿微生物主要是自养菌，琼脂等凝固剂中的有机物质及其水解产物对浸矿微生物生长有抑制作用，酸性的固体培养基难以制作，所以浸矿微生物通常难以在固体平板上产生大量有特色的菌落供菌株筛选、选育及遗传特性研究。因此，高活性的浸矿微生物菌种资源缺乏，浸矿机理不明，导致生物浸出技术浸出速率慢，限制其大规模工业化应用。 

为提高浸矿微生物检出率并缩短培养周期,双层平板方法发明并用于该类微生物的分离筛选。双层平板中采用底层涂布嗜酸的(Candida digboiensis sp.)等异养菌以除去培养基中的有毒有机物质,上层用于化能自养菌的筛选。双层平板中的培养基成分也不断改进，但目前该方法仍存在很大挑战。 

本发明筛选了一种嗜酸酵母，利用其设计了一种新型的分离纯化极端浸矿菌的双层平板，该酵母菌除去培养基中的有毒有机物质的作用明显，成功的实现了浸矿菌的固体平板培养及纯化。 

发明内容

本发明的目的是通过筛选酸性浸矿体系中的嗜酸酵母，提供一种利用该菌建立的快速筛选浸矿微生物的双层平板及其制备方法，以丰富浸矿微生物资源,成功的实现浸矿菌的固体 平板培养及纯化。 

一种双层平板，是在双层培养基平板的底层平板中接种有嗜酸酵母(Candida digboiensisZBY)，所述的嗜酸酵母(Candida digboiensisZBY)的保藏编号为:CCTCC NO：M2013311。 

所述的双层平板的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 

1）挑选嗜酸酵母(Candida digboiensisZBY)单菌落置于含1wt%的葡萄糖和0.025wt%的胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）的5mL9k液体培养基中活化至菌液浓度达到10⁹个/mL以上，取占体积比10%的活化好的培养液加入含1%葡萄糖的9K液体培养基中，得到酵母菌培养液； 

2）分别配制以下三种溶液：(a)pH=2.0的2×9K液体培养基（即培养基中，每种成分的浓度均为2倍），(b)pH=2.0的250mM的硫酸亚铁溶液，其中含10mM K₂S₄O₆；(c)pH=4.5的3wt％琼脂糖溶液；50℃时将(a)(b)(c)三种溶液按体积比4：1：5混合，制备成分离和纯化用培养基2份； 

3）其中1份立即接种步骤1）得到的酵母菌培养液，接种量为培养基体积比的1%，然后倾倒在无菌培养皿中形成凝胶，另一份保温，当培养皿内的凝胶凝固，再倒入第二份无酵母的培养基，制成双层平板。 

所述的酵母菌为嗜酸酵母(Candida digboiensisZBY)，保藏编号为:CCTCC NO：M2013311。保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2013年7月2日。 

本发明筛选了一种嗜酸酵母，利用其设计了一种新型的分离纯化极端浸矿菌的双层平板，该酵母菌除去培养基中的有毒有机物质的作用明显，成功的实现了浸矿菌的固体平板培养及纯化。 

附图说明

图1为酵母(Candida digboiensisZBY)显微形态； 

图2为本发明利用酵母(Candida digboiensisZBY)制作的双层平板； 

图3为本发明双层平板筛选的浸矿微生物菌落形态和扫描电子显微镜照片（SEM）图像； 

（a）底层接种酵母，上层接种浸矿微生物的双层平板； 

（b）Z1菌的SEM图像； 

（c）Z2菌的SEM图像。 

具体实施方式

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。 

实施例1嗜酸酵母(Candida digboiensisZBY)的分离筛选和鉴定: