本申请涉及一种酸性D‑氨基酸氧化酶的突变体,构建方法及其在酶法拆分草铵膦中的应用。所述酸性D‑氨基酸氧化酶突变体是在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列基础上包含以下至少一个突变位点:H70S、I74A、G244Q、Q337G。本发明构建的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET30a‑DAAO具有高产酸性D‑氨基酸氧化酶的性质,用于催化外消旋型D,L‑PPT的氧化反应,在300mM底物浓度下可于6h内达到最高49.8%的转化率,转化效率远高于野生型DAAO的转化效率,可应用于微生物酶法拆分外消旋型草铵膦以及绿色高效生产L‑草铵膦。