[发明专利]一种计数植物乳杆菌活菌数的方法及其引物和试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种计数植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）ST-III活菌数的方法及其引物和试剂盒。

背景技术

光明乳业股份有限公司筛选的专利菌株植物乳杆菌ST-III，具有降血脂、降胆固醇、减肥等益生功效，但是植物乳杆菌的种类很多，并不是所有植物乳杆菌都具有这些功能。而且益生菌要发挥益生功能，其活菌数必需大于10⁶cfu/g，产品中植物乳杆菌ST-III的活菌数决定着产品的质量与功能。为此，有必要发展准确的特定菌株活菌计数技术。

到目前为止，已经有一些应用PCR检测鉴定植物乳杆菌ST-III的方法。如专利CN102453767A中公开了一种快速定量检测植物乳杆菌ST-III的方法及其试剂盒，该方法的基本操作包括：提取待检样品的总RNA，反转录成cDNA，再做荧光定量。由于菌体内的RNA分解速度较快，通常只有在菌体保持新鲜的状态下才能获得较准确的结果，因此该方法只适合于对新鲜的样品进行计数。当样品存放一段时间后，产品中的活菌数可能变化不大，但是提取的RNA却可能发生部分降解，从而影响计数的准确性。此外，该方法的检测极限仅为2.85x10³cfu/mL，并在检测过程中常伴有正负1个数量级的误差，而且该方法的操作过程很繁杂，对实验者的要求很高，更由于所使用的部分试剂有毒，因此在实际应用中难以推广。又如，专利CN102533790A中公开了一种检测植物乳杆菌ST-III的PCR检测方法及其引物和试剂盒，该方法能特异性地检测植物乳杆菌ST-III，但却不能区分产品中的死菌与活菌，且在PCR反应中常出现假阴性和假阳性，所以该方法也无法对样品中的植物乳杆菌ST-III的活菌数进行准确的计数。因此，到目前为止，本领域尚缺乏系统的、能够准确定量检测植物乳杆菌ST-III活菌的计数方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对目前对植物乳杆菌ST-III的定量检测方法灵敏度不够高、准确性较差且操作复杂的缺陷，而提供一种新的计数植物乳杆菌ST-III活菌数的方法及其引物和试剂盒。本发明的方法及其引物和试剂盒用于测定植物乳杆菌ST-III，其操作简单，特异性强，灵敏度高，能够方便、快速地测定样品中植物乳杆菌ST-III的活菌数，为具有特定功能的植物乳杆菌ST-III的应用打下基础；同时也为研究其它功能性菌株的活菌计数方法提供了有益参考。

本发明提供的技术方案之一是：一种对样品中植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）ST-III活菌进行计数的方法，其包括如下步骤：

（1）以平板计数法计数样品中的活菌数X；

（2）分别提取步骤（1）所述平板上所长的Y个单菌落的基因组DNA，以所得的基因组DNA为模板分别进行PCR反应，所述PCR反应的反应体系中加入SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的引物以及检测细菌16S rRNA的通用引物对；

（3）根据步骤（2）所得反应产物中阳性条带的存在与否统计阳性菌落数Z，即得样品中植物乳杆菌ST-III的活菌数W，W=X×Z÷Y。

本发明步骤（1）中，所述的平板计数法为本领域常规所述，一般是先将待测样品进行梯度稀释，将稀释后的样品涂布计数平板，直至在计数平板上长出单克隆，对单克隆菌落进行计数即可。所述的计数平板可以为本领域常规，如MRS固体平板、TPY固体平板和BBL固体平板等。较佳地，在本发明中，所述平板计数法为采用MRS固体平板培养稀释后的样品，直至在MRS固体平板上长出单克隆，对单克隆菌落进行计数，所得菌落数代表样品中的活菌数X。

本发明步骤（2）中所述分别提取步骤（1）所述平板上所长的Y个单菌落的基因组DNA一般按常规分子生物学检测的方法进行，所述Y的数量可为任意的适合于常规实验操作进行的数目，一般在10～100之间为佳。

本发明步骤（2）中，所述的检测细菌16S rRNA的通用引物对为本领域常规所述，只要其能够扩增出细菌16S rRNA的对应片段即可，以此作为检测时的阳性对照，防止假阴性的发生。较佳地，所述的检测细菌16S rRNA的通用引物对为序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对。