[发明专利]一种计数植物乳杆菌活菌数的方法及其引物和试剂盒

权利要求书

1.一种对样品中植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）ST-III活菌进行计数的方法，其特征在于，其包括如下步骤：

（1）以平板计数法计数样品中的活菌数X；

（2）分别提取步骤（1）所述平板上所长的Y个单菌落的基因组DNA，以所得的基因组DNA为模板分别进行PCR反应，所述PCR反应的反应体系中加入SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的引物以及检测细菌16S rRNA的通用引物对；

（3）根据步骤（2）所得反应产物中阳性条带的存在与否统计阳性菌落数Z，即得样品中植物乳杆菌ST-III的活菌数W，W=X×Z÷Y。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述的检测细菌16S rRNA的通用引物对为序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述PCR反应的扩增程序为：①93～96℃，4～6min；②93～96℃，20～40s；③53～58℃，20～40s；④70～74℃，20～40s；⑤70～72℃，5～10min；其中，步骤②至④的循环数为25～35；所述PCR反应的反应体系包括如下终浓度的各组分：0.2～0.4μmol/L序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物、0.15～0.35mmol/L dNTP、0.8～1.2×PCR buffer、0.8～1.8mM的Mg²⁺、0.015～0.025U/μL Taq DNA聚合酶和0.5～2ng/μL模板。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述PCR反应的扩增程序为：①95℃，5min；②95℃，30s；③55℃，30s；④72℃，30s；⑤72℃，5min；其中，步骤②至④的循环数为30；所述PCR反应的反应体系包括如下终浓度的各组分：0.25μmol/L序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物、0.2mmol/L dNTP、1×PCR buffer、1mM的Mg²⁺、0.02U/μL Taq DNA聚合酶和1ng/μL模板。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述阳性条带包括由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示引物扩增出的173bp的条带和由SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的通用引物对扩增出的362bp的条带。

6.一种检测植物乳杆菌ST-III的引物对，其特征在于，其包括序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的引物。

7.一种用于检测植物乳杆菌ST-III的试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求6所述的检测植物乳杆菌ST-III的引物对。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对。

9.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括dNTP、PCR buffer、Mg²⁺、Taq DNA聚合酶和dd H₂O中的任一种或多种。

10.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括基因抽提试剂。