[发明专利]一种辣椒疫霉菌LAMP引物及其快速检测方法

说明书

技术领域

    本发明涉及一种辣椒疫霉菌LAMP引物及其快速检测方法，专用于辣椒疫霉菌高灵敏度快速分子检测，同时可用于田间辣椒疫病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域。

背景技术

辣椒疫病是一种世界范围内普遍发生的毁灭性真菌病害，其首先于1918年在美国新墨西哥州发现，引起辣椒疫病的辣椒疫霉菌Phytophthora capsici Leonian是Leon Leonian于1922年命名的，它属于植物病原卵菌。辣椒疫霉以卵孢子或厚垣孢子在土壤病残体中越冬，可以存活数月甚至更长时间，寄主范围广，主要侵染辣椒、番茄、茄子、黄瓜、南瓜等多种重要蔬菜作物。辣椒疫病露地和保护地均能发生，该病的流行致使辣椒损失严重，一般病株率为15–30％，严重时达80％以上。自1980年以来，辣椒疫病在我国蔬菜种植区域发病程度日趋加重，严重影响了蔬菜种植业的经济效益，给我国的蔬菜安全生产造成了巨大的经济损失。因此，预防与控制由辣椒疫霉引起的蔬菜疫病的爆发成为保障我国蔬菜生产的重要任务。对发病植物进行快速准确的病害诊断、对无病植物材料和植物生长环境中病原菌的及时检测和监测是控制植物病害发生、流行和成灾的重要基础。因此建立辣椒疫霉菌快速检测体系，早期对发病植株及土壤进行疫霉菌快速准确检测，对预测病害发生情况、及时采取有效的防治措施控制病原菌的传播和流行、减少经济损失都具有重要的理论和实际意义。

目前对辣椒疫霉菌的检测大多仍沿用传统的培养及鉴定方法，传统的病原菌检测技术是在分离得到病原物的基础上，通过形态学观察和柯赫氏法则来判断病原物的种类。整个过程常常需要耗费大量的劳动力和时间，一般需要几天才能完成。而且要求操作者具备专业的病原菌分离、形态学鉴定知识和丰富的经验。因此，以形态特征为基础的常规病害诊断技术，由于其耗时长，效率低，难以满足对辣椒疫病诊断的实际需要，因其很容易错过病害防治的最佳时期。因此，建立一套快速、灵敏、准确的辣椒疫霉菌检测诊断技术不仅非常必要，而且十分迫切。

PCR技术为植物病原诊断提供了快速、灵敏、准确的优势，然而目前PCR特异性检测技术仍然需要PCR仪、电泳和凝胶成像系统等昂贵的专业仪器和分子生物学试剂，且需要分子生物学专业实验人员操作，限制了PCR检测方法的推广应用。循环恒温扩增技术（Ioop-mediated isothermal amplification，简称LAMP）是2000年由日本荣研株式会社Notomi等人开发的一种新型循环恒温核酸扩增技术。LAMP反应针对靶基因的6个位点设计出4条引物，利用一种链式置换活性的DNA聚合酶（Bst DNA polymerase），在恒温条件下（60–65℃）保温30–90分钟，即可完成扩增反应。由于LAMP反应的高效性和等温快速扩增的特点，在90分钟内可扩增10⁹–10¹⁰倍产物。LAMP扩增产物的检测一般采用荧光染料目测观察、琼脂糖凝胶电泳和浊度观察等方法。由于LAMP反应简单、快速、高效、经济等特征，因而具有极为广泛的应用前景。目前LAMP检测主要应用于人畜病原物、食品安全和环境卫生的检测，在植物病原菌检测中报道极少，辣椒疫霉菌的检测国内外均未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中辣椒疫霉菌的生物学检测方法所需周期长、检测方法特异性差，灵敏度低的问题，提供一种辣椒疫霉菌的LAMP检测引物以及结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高的辣椒疫霉菌的快速检测方法。

实现本发明的目的包括下列步骤：

1．LAMP引物的设计

我们从GenBank中下载辣椒疫霉ITS基因（登录号：FN257934）序列，根据辣椒疫霉ITS基因序列，采用PrimerExplorer V4软件设计一种LAMP检测引物，包括2条外引物(F3 和 B3) 和 2条内引物 (FIP 和 BIP)，引物序列分别为：

F3：5’- TTGGCTTCGGCTGAACAG -3’ ；

B3：5’- GCGGGAAATTCTTGCCTGAA -3’；

FIP：5’- CGCAACAGCAAAGCCGATTCAA-ATGCTTTTCCTGCTGTGGC -3’；

BIP：5’- GGCTGTCGAGGGTCGATCCA-AGGTCCAATTGAGATGCGC -3’。

2．辣椒疫霉菌快速检测体系的建立