[发明专利]一种生产治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体的方法、其制品及杂交瘤细胞

说明书

技术领域

本发明涉及单克隆抗体生产的技术领域，具体涉及一种生产治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体的方法、其制品及杂交瘤细胞。

背景技术

1975年Koehler和Milstein（Nature Vol.256，pp495-497），采用细胞杂交技术，将绵羊红细胞（SRBC）免疫的小鼠脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞融合，成功获得了抗SRBC的单克隆抗体。创建了具有划时代意义的杂交瘤单克隆抗体技术，为生物技术打开了一个全新的领域。目前，该技术的应用已涉及医学、农业、食品、环境等众多领域，广泛应用于基础研究、疾病诊断、环境与食品检测、治疗、预防、蛋白提纯等方面。随着单克隆抗体在体内诊断和治疗中的应用，对单克隆抗体产品也提出了更高的要求，从而促进了体外大规模培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体的技术发展。该技术也随着机械化工、计算机学科的发展而日益完善，为生物医学（包括人类和兽医）的各个领域，尤其在病毒感染的预防和治疗的基础研究和临床应用领域，发挥其重要的作用。

犬瘟热（Canine Distemper,CD）是由犬瘟热病毒（Canine Distemper virus,CDV）引起的，感染肉食兽中的犬科（尤其是幼犬）、鼬科及一部分浣熊科动物的高度接触传染性、致死性传染病。以早期表现双相热型、急性鼻卡他，及随后的以支气管炎、卡他性肺炎、严重的胃肠炎和神经症状为特征。少数病例出现鼻部和脚垫的高度角化。该病传染性强、发病率高，经常引起大批犬、貂、狐等动物发病，致死率30%～80%，雪豹高达100%。另外，该病毒感染还威胁到实验用犬。目前临床上对该病毒感染的治疗主要是对症治疗，配合高免血清和单克隆抗体治疗。制备治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体的传统方法是体内生产法。此方法将融合产生的犬瘟热病毒单克隆杂交瘤细胞接种于小鼠（非同系动物）腹腔中，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，诱导产生大量腹水，同时，犬瘟热病毒单克隆杂交瘤细胞分泌抗体于腹水中，而得到大量的腹水单抗。一般而言，该类腹水中常混有小鼠的各种杂蛋白（包括Ig），因此要提纯后才能使用；另外，这种方法的产量低，生产周期长、批间差异大，不适合进行批量化的治疗性单抗的生产。

目前，亟需能生产出具有纯度高，批间差异小，质量易控，可显著提高治疗性单克隆抗体质量的治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体的方法。

发明内容

根据上述领域的需求和不足，本发明提供一种生产治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体的方法，本发明还提供由该方法直接获得的治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体。本发明方法生产的治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体纯度高，批间差异小，质量易控，可显著提高治疗性单克隆抗体质量。另外，本发明还提供分泌抗犬瘟热病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞。

本发明的技术方案如下：

一种生产治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将分泌生产治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞于细胞培养液中进行扩大培养；

(2)再接种到生物反应器内的细胞培养液中进行培养；

(3)收获杂交瘤细胞所生成的治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体。

所述细胞培养液的配方是：85%DMEM液、15%犊牛血清、添加200单位/ml青霉素钠和200单位/ml硫酸链霉素；或无血清杂交瘤细胞培养基，添加200单位/ml青霉素钠和200单位/ml硫酸链霉素。

接种密度是1×105～1×106/ml。

接种密度是2×105～8×105/ml，其中步骤（2）中采用批式、连续灌流或换液收取方式在生物反应器中培养所述杂交瘤细胞。

接种密度是4×105～5×105/ml，培养所述杂交瘤细胞的培养温度在36～37℃之间，所述细胞培养液的pH值为7.0～7.2，所述生物反应器的溶氧范围设为50%～90%。

当采用连续灌流方式培养杂交瘤细胞时，流加体积为每天1～5罐体积。

上述方法的特征在于，所述杂交瘤细胞的保藏号为：CGMCC No.7613。

还包括如下步骤：将步骤（3）收获的生产治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体进行浓缩与纯化，再无菌、定量分装到灭菌的容器中。

上述方法生产的治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体。

一种杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCC No.7613。

在本发明中，“生物反应器”是指为培养生长的和非固定化的细胞提供良好封闭环境的生物反应装置，通常又称为细胞发酵罐。有多种生物反应器可以适用于本发明中，包括例如搅拌式生物反应器、气升式生物反应器、中空纤维生物反应器和流化床生物反应器等。