[发明专利]一种检测阪崎杆菌用核酸侧向流试纸条的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和免疫学领域，涉及食品及加工原料中阪崎肠杆菌的核酸扩增产物侧向流免疫胶体金试纸条试剂盒的制备和应用方法。 

背景技术

为有效控制食品生产和进出口贸易中因致病性微生物引起的食源性疾病，保证食品领域的公共安全，需要开发灵敏、便捷、准确的食源性病原微生物检测方法。在食源性疾病危险因素中，在我国流行的食源性疾病中，微生物性食物中毒位居第一，而在食源性病原微生物中其中最典型的致病菌是阪崎肠杆菌、福氏志贺氏菌、金黄色葡萄球、单增李斯特菌、大肠杆菌O157：H7等病原菌。阪崎肠杆菌是人和动物肠道内寄生的一种革兰阴性无芽孢杆菌，属肠杆菌科肠杆菌属，是肠道正常菌丛中的一种，在一定条件下可引起人和动物致病，阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症，并且可引起神经系统后 遗症和死亡。阪崎肠杆菌感染的大多数病例都是婴儿，特别是早产儿、 出生体重偏低等身体状况较差的新生儿。2008年,阪崎肠杆菌被提议由原分类种名Enterobacter Sakazakii重新定义为隶属于肠杆菌科的一个包含有5个新种的新属Cronobacter。，该属内五个种之间毒力作用存在差异。 

在传统的食品生产、质量监督和进出口检验检疫中常规的细菌培养及鉴定方法，检验步骤繁琐，检验周期长，同时对于有些细菌仍无法给出快速和准确的鉴定，不能完全满足农产品及进出口检验检疫的检测要求。基于核酸扩增的方法检测对象是来自病原微生物的DNA，经特异性扩增后进行产物鉴定，这类方法因灵敏度高，特异性好，耗时少而发展迅速，主要的方法包括普通/荧光PCR方法、核酸恒温扩增的LAMP和NASBA方法以及基因芯片技术。 

荧光定量PCR技术是一种高灵敏度核酸检测和定量方法，基本原理是在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断积累，荧光信号强度也等比例增加。荧光定量PCR具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性，具有实时性和准确性等特点，特别是依赖探针结合的TaqMan方法，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。但是，实时定量PCR检测对设备依赖性强，难以实现现场检测，常规的PCR扩增检测需要对PCR产物凝胶电泳后进行图像采集和分析，耗费时间较长，且难以保证检测的灵敏度。公开号为CN102816761的发明专利“阪崎肠杆菌的高特异性基因片段及其应用”提供了一种以16S RNA序列作为PCR检测对象的鉴定方法，发明专利“阪崎肠杆菌的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和检测试剂盒”（公开号：CN102154451）、“阪崎肠杆菌快速检测试剂盒及其检测方法”（公开号：CN101319249A）及公开号为CN101368204 

的发明专利“阪崎肠杆菌环介导等温扩增技术快速检测用引物、试剂盒和检测方法”各自设计了环介导等温扩增的特异引物和检测方法，发明专利“快速检测婴幼儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的PCR方法及试剂盒”（公开号：CN102127592）描述了以标准质粒结合定量检测进行奶粉中阪崎杆菌定量检测的方法，以上方法均以特异引物为基础，后续的检测以荧光实时定量结果为判据。

  

另一类检测方法是基于双抗体夹心的免疫学检测方法，其检测对象主要是蛋白质分子，竞争法检测的对象为小分子化合物和半抗原分子，这两种免疫学检测方法都可以用免疫胶体金试纸条的方法实现，是快速检测的常规方法，具有快速、简单、成本低廉的优点，广泛用于食品中毒素、病原微生物以及农药、抗生素残留的筛查。过去病原微生物的免疫学检测主要依据上述抗原与抗体的结合反应，“检测阪崎肠杆菌的酶联免疫吸附测试方法及其中所用的抗体”（公开号：CN101082624A）提供了一种可识别阪崎杆菌α-葡萄糖苷酶的特异性抗体的制备方法以及在酶联免疫吸附（ELISA）中的使用方法。在免疫胶体金检测中，利用抗原和抗体的特异性结合的特点，形成抗原一抗体一有色颗粒复合物而富集在包被线上，形成肉眼可见的有色沉淀线，对蛋白的检测依赖高亲和力和高特异性抗体的获得，在病原物分析时因为基因编码的规律和简并规则，DNA较蛋白质更易于产生序列差异，这种差异也更易于准确检出，通过将免疫学检测的方法移植于核酸产物检测可以有效提高核酸产物的检测效率，通过在PCR扩增引物中引入特殊的标记物就可以实现双链产物的免疫学检测。