[发明专利]连作花生土壤真核微生物群落演替的分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种连作花生土壤真核微生物群落演替的分析方法，属于土壤微生物与农作物栽培技术领域。

背景技术

花生是世界重要的油料作物和经济作物，适应性很广，但是其生长和产量受连作影响严重。土壤微生物由于参与诸如土壤中矿物质的循环、有机质降解、土壤结构形成以及有毒物质的转化和积累等过程，对维持土壤肥力和土壤生态功能的稳定发挥重要作用。另外，土壤中致病菌与拮抗菌之间的相互作用对植物的生长发育也起到非常重要的作用。由于微生物能够对环境变化做出快速反应，因此，微生物群落结构的变化通常作为环境变化情况和土地耕种情况的有效生物指标。

作物连作障碍与土传病害增加密切相关，而土壤真核微生物尤其是真菌和线虫是主要的土传病害原因。通过分析花生连作过程中土壤真核微生物群落结构的演替情况，了解微生物类群在连作过程中具体的变化规律，可以获知与花生连作障碍相关的真核微生物类群，结合功能分析，了解花生连作过程中潜在的致病微生物类群，以及其群落结构在连作过程中变化规律。但是，目前还没有分析花生连作过程中具体微生物类群演替规律的有效方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种连作花生土壤真核微生物群落演替的分析方法，以获知在花生连作条件下，土壤真核微生物的群落结构以及优势类群，了解在连作过程中土壤真核微生物具体类群的演替规律。

为达到上述目的，本发明所采用的技术手段是：一种连作花生土壤真核微生物群落演替的分析方法，采用盆栽试验，选取未种植过花生的土壤，充分混匀后分与各盆，连续三年种植花生，连作三年的种植周期时间一致；每个种植周期内分别选取苗期、收获期收集花生根部土壤，并提取土壤基因组DNA，构建18S rRNA基因文库；最后对所构建的六组18S rRNA基因文库数据进行分析，得出演替规律。

进一步的，所述盆栽试验中使用的盆是指底部带有透水孔，最大直径35-40cm，高度30-40cm的瓦盆。

作为优选，所述未种植过花生的土壤，其成分为：28.5% 粘土，41% 有机土和 30.5% 沙。

作为优选，所述连续三年种植花生，指每年花生收获后不再栽培其它作物。

作为优选，所述连续三年种植花生，种植过程中采用四周通风的大棚遮挡雨水，用无菌水浇灌，整个种植过程不施加肥料。

作为优选，所述每个种植周期分别选取苗期、收获期收集花生根部土壤，所指苗期为出苗20天，收获期则是花生饱满成熟时；所述收集花生根部土壤，是指每个时期任意选取三株花生为样本，每个样本在距离主根3-5cm、8-10cm和13-15cm的位置分别取样，每个距离分别重复取两次，所取样品充分混匀作为一个分析样本，用液氮快速冷冻后于-80℃保存备用。

作为优选，所述构建18S rRNA基因文库，所用引物为：

18S-F: 5'-ATTCCTAGTAAGCGCGAGTCATCAG-3'；

18S-R: 5'-CAATGATCCTTCCGCAGGTTCAC-3' ；PCR扩增退火温度为55℃，扩增25个循环，25μL体系扩增6管，混合到一起作为后续纯化、建库的材料。

本发明的有益效果在于：本发明能获知在花生连作条件下，土壤真核微生物的群落结构以及优势类群，了解在连作过程中土壤真核微生物具体类群的演替规律，具有效率高、周期短、全面展示土壤真核微生物具体类群的优点。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步说明本发明的技术方案。

一种连作花生土壤真核微生物群落演替的分析方法，采用盆栽试验，选取未种植过花生的土壤，充分混匀后分与各盆，连续三年种植花生。每年4月底播种，9月底收获。每年花生收获后不再栽培其它作物。种植过程中采用四周通风的大棚遮挡雨水，用无菌水浇灌，整个种植过程不施加肥料，以减少外界环境对土壤微生物的影响，尽可能真实反应花生连作与土壤微真核生物之间的作用关系。每个种植周期分别选取苗期、收获期收集花生根部土壤。每个时期随机选取三株花生为重复样本，每个样本在距离主根3-5 cm、8-10 cm和13-15 cm的位置分别取样，每个距离分别取两个重复。取样深度为表层以下5-10cm，目的是减少外界环境的干扰。采用试剂盒提取土壤基因组DNA，并构建18S rRNA基因文库。