[发明专利]番茄环纹斑点病毒RT-LAMP检测方法、引物组及其应用

说明书

技术领域

本发明属于番茄环纹斑点病毒检测技术领域，尤其涉及一种番茄环纹斑点病毒RT-LAMP检测方法、引物组及其应用。

背景技术

番茄环纹斑点病毒(Tomato zonate spot virus，TZSV)属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)番茄斑萎病毒属(Tospovirus)，是中国于2008年首次报道的Tospovirus的一个新种，该病毒可以通过汁液进行传播，也可由烟蓟马和西花蓟马进行传播。TZSV自然条件下可侵染番茄、辣椒、马铃薯和烟草等24种作物及杂草。TZSV在番茄、烟草的整个生长发育期均可侵染为害，苗龄愈小，环境温度愈高，发病愈重。2009年在广西靖西县的调查显示，TZSV发病率达10%以上的烟草面积约有2000亩，严重的地块发病率达41%，许多烟苗病死，烟田呈现严重的缺苗现象；德保县发病率达10%-30%以上的面积约1500亩，2010年病情依然较为严峻，病株率达10.17%。另据报道，该病害在云南昆明、玉溪、红河等多地均有发生，给当地的番茄、辣椒及烟叶生产造成严重的损失。2011年，由番茄环纹斑点病毒TZSV引起的病害在滇南、滇中烟区广泛发生，部分烟区大田发病率在3%～5%之间，重病田块达到20%左右。2012年，云南红河州泸西县由于TZSV侵染番茄造成5333.3hm2的番茄绝收，给当地的番茄生产造成了极大的损失。

目前针对番茄环纹斑点病毒的检测主要有电镜观察法、分子生物学方法、血清学方法，它们都需要昂贵的仪器（PCR仪、电镜等），且较为费时。环介导恒温核酸扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一种先进的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等温条件(65℃左右)保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应，通过荧光染色的方法在数分钟内即可观察结果。该法不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程。LAMP是一种崭新的DNA扩增技术，具有简便、快速、特异性强等特点，目前已广泛应用于人类或动植物的各种病毒、细菌等引起的疾病或病害的快速检测和快速诊断。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种简便、快速、特异性强的番茄环纹斑点病毒RT-LAMP检测方法、引物组及其应用。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：番茄环纹斑点病毒RT-LAMP检测引物组，包括外侧引物对F3和B3、内侧引物对FIP和BIP，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列。

番茄环纹斑点病毒RT-LAMP检测试剂盒，该试剂盒包括A试液，A试液为LAMP反应体系，含有RT-LAMP Mix（2×）、AMV-Bst混合液、RNase-Free Water、RT-LAMP检测引物组。

该试剂盒每剂A试液含RT-LAMP Mix（2×）12.5μl、AMV-Bst混合液1.5μl、RNase-Free Water2.8μl、RT-LAMP检测引物组6.2μl，其中FIP和BIP引物各2.5μl，终浓度均为1μM；F3和B3引物各0.6μl，终浓度均为0.25μM；引物F3、B3、FIP和BIP分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列。

该试剂盒还包括B试液和C试液；B试液含番茄环纹斑点病毒RNA，作为阳性对照；C试液为去离子水，作为阴性对照。

番茄环纹斑点病毒RT-LAMP检测方法，利用RT-LAMP检测引物组，在60-63℃恒温反应条件下，进行环介导恒温扩增反应30-120min，扩增完成后80℃再反应10min，然后利用琼脂糖凝胶电泳或荧光染色，鉴定植株样品是否感染番茄环纹斑点病毒；RT-LAMP检测引物组包括外侧引物对F3和B3、内侧引物对FIP和BIP，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列。

外侧引物对与内侧引物对的浓度比例为1:4。

外侧引物对与内侧引物对的浓度分别为0.25μM和1μM。

上述番茄环纹斑点病毒RT-LAMP检测方法在烟草、辣椒、番茄或杂草上的应用。