[发明专利]耐甲氧西林金黄色葡萄球菌三重实时荧光PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Meth icil lin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的三重实时荧光PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法。

背景技术：

Jevons于1961年在英国首次报道了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Meth icil lin-resistant S taphylococcus aureus,MRSA)，现成为全球性的病原微生物，与乙型肝炎、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)同时列为世界上最难解决的三大感染性顽症。目前MRSA耐药检测常用的方法有纸片扩散法、肉汤稀释法、琼脂筛选法、分子生物学诊断方法等。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Meth icil lin-resistant S taphylococcus aureus,MRSA)及耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(Methicillin-resistant coagulase-nega tive staphy lococci,MRCNS)现已成为医院和社区感染的常见病原菌，发病率有逐年上升趋势。mecA(Methicillin determ inant A)是MRSA的耐药决定基因，编码与β-内酰胺类抗生素亲和力极低的PBP2a，促进细菌胞壁合成而耐药，现已明确mecA基因只存在于葡萄球菌中，位于一个由不同整合子、转座子等组成的可移动元件上，因此，mecA基因可作为耐甲氧西林葡萄球菌的分子标志，但mecA基因存在于所有耐甲氧西林葡萄球菌中，且特异和保守，所以只检测mecA基因不能确定为MRSA。femA是甲氧西林耐药的辅助基因，femA插入失活，将导致β-内酰胺类抗生素敏感性上升，femA基因可用于MRSA与MRCNS间鉴别。Francois等将拭子标本中的MRSA增菌后，采用实时荧光PCR方法分别扩增目标FemA和mecA基因，用于鉴定样本中是否含有MRSA，方法的灵敏度优于CLSI推荐方法。耐热核酸酶nuc是金黄色葡萄球菌的特异性酶，通过编码耐热核酸酶的nuc基因的特异扩增可鉴定金黄色葡萄球菌有非常好的特异性。

发明内容：

本发明的目的是提供一种快速、可靠、灵敏度高、特异性强的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌三重实时荧光PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法，通过一次反应就能完成耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的特异性检测，还可检测MRCNS及甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌。

本发明的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌三重实时荧光PCR检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：

针对nuc基因：5`-GATACACCTGAAACAAAGCATCC-3`；（如SEQ ID NO.1所示）

5`-GACCTTTGTCAAACTCGACTTC-3`；（如SEQ ID NO.2所示）

针对mecA基因：5`-GAAGGTGTGCTTACAAGTGC-3`；（如SEQ ID NO.3所示）

5`-TCAACTAACTATTGATGCTAAAGTTCAA-3`；（如SEQ ID NO.4所示）

针对femA基因：5`-GCCACTATGAGTTAAAGCTTGC-3`；（如SEQ ID NO.5所示）

5`-TCACTGGACCGCGATTTG-3`；（如SEQ ID NO.6所示）

本发明的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌三重实时荧光PCR检测探针，其特征在于，所述的检测探针如下所示：

nuc基因的探针：5`-AGGTGTAGAGAAATATGGCCCTGAAGC-3`；（如SEQ ID NO.7所示）

mecA基因的探针：5`-TTATGGCTCAGGTACTGCTATCCACCC-3`；（如SEQ ID NO.8所示）

femA基因的探针：5`-ACGAGGTCATTGCAGCTTGCTTACT-3`；（如SEQ ID NO.9所示）

探针的5`端标记有荧光报告基团，3`端标记有荧光淬灭基团，三探针的5`端标记的荧光报告基团是不同的荧光报告基团。

所述的荧光报告基团优选为TET、HEX或FAM，所述的荧光淬灭基团优选为BHQ1。

本发明的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌三重实时荧光PCR检测试剂盒，包括实时荧光定量PCR反应液、耐热DNA聚合酶、检测引物和检测探针，其特征在于，

所述的检测引物包括三对：