[发明专利]一种鉴别拟枝孢镰刀菌和木贼镰刀菌感染致木耳白毛菌病的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种鉴定木贼镰刀菌（Fusarium equiseti）和拟枝孢镰刀菌（Fusarium sporotrichioides）感染导致木耳“白毛菌病”的分子生物学方法。 

背景技术

木耳[Auricularia auricula-judae(Bull.)Quél.]，又名黑木耳、光木耳，为著名的食用菌和药用菌，其质地滑嫩，清脆可口，营养丰富，有“素中之荤”的美誉。木耳有较高的药用价值，能补气血，凉血止血，润肺益胃，舒筋活络，轻身强志，还有降低血小板凝聚、防治心脑血管疾病的奇效。此外还可抑制癌细胞，增强人体免疫功能，成为公认的“天然保健食品”，越来越受到市场的青睐。木耳栽培起源于中国，作为世界木耳的主产国，2011年中国木耳产量超过300万吨，遍及全国二十多个省（区）。我国木耳主产区东北产区因气温低、昼夜温差大等独特的气候特点使所生产的木耳色黑肉厚，品质好，闻名遐迩。因此，木耳栽培生产范围也逐年扩大，配套栽培设施和技术逐渐完善，产量也不断提高，木耳产业已发展成为我国许多山区和林区的富农产业。然而，由于在木耳栽培生产中可发生多种病害或杂菌污染，导致木耳品质下降、产量降低，病害严重的甚至绝产，木耳产业的健康发展则受到了严重威胁。 

近年来，在东北产区春季木耳普遍发生了被木耳栽培农民称为“白毛菌”的病害，已给许多栽培农户造成了较大的经济损失。该病原菌在盛夏伏天侵染木耳的子实体，在耳片腹面生长一层白色网状霉菌，呈绒毛状，即使在木耳晒干后霉层依然存在，在严重发生时可导致耳片霉烂，严重影响木耳的产量及商品价值（见图1和2）。病害一旦发生，就会导致大面积蔓延，因此，对该病害病原菌进行及时准确的鉴定及采取针对性的有效防治措施十分必要。只有尽快鉴定病原菌种类，才能采取相应措施对该病害进行有效防治，防止病害迅速蔓延，将损失减少到最小，具有十分重要的意义。 

迄今为止，申请人于2011年报道了尚志地区的“白毛菌”病害，证明了引起木耳“白毛菌病”的病原菌为尖孢镰孢（F.oxysporum）和厚垣镰孢（F.chlamydosporum）。鉴定方法是通过形态鉴定和ITS序列分析，即通过提取病原菌DNA，用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增，获得的PCR产物进行测序 分析，将序列在NCBI中进行BLAST分析，通过与已知序列的高同源性并结合病原菌培养的菌丝及孢子形态来确定病原菌，方法繁琐、耗时长。 

发明内容

本发明的目的是提供一种更加快速而准确鉴定木贼镰刀菌（Fusarium equiseti）和拟枝孢镰刀菌（Fusarium sporotrichioides）感染导致木耳“白毛菌病”的分子生物学方法，利用一对特异性引物鉴别木耳白毛菌病的病原菌，方法快速，缩短鉴定时间，可以及时采取防治措施，减少病害造成的损失。 

本发明按照如下方法鉴别拟枝孢镰刀菌和木贼镰刀菌感染致木耳“白毛菌病”： 

挑取黑木耳病变部位霉层或菌丝少许，加无菌蒸馏水煮沸后离心，取上清液作为模板，采用一对特异性引物，进行PCR反应，产物进行琼脂糖凝胶电泳40min，查看条带确定病原菌，若PCR产物大小为400bp，则为木贼镰刀菌（F.equiseti）；若PCR产物大小为332bp，则为拟枝孢镰刀菌（F.sporotrichioides），具体步骤如下： 

1、用无菌接种针挑取黑木耳病变部位霉层或菌丝少许，置于含100～500μL无菌水的1.5ml离心管中，煮沸5～10min，5000～10000rpm/min离心1～10min，取上清液0.1～5.0μL作为模板。 

2、PCR反应的引物由TaKaRa公司合成。 

引物1： 

E-P1：TTACCAGTAACGAGGTGTATG； 

E-P2：CATACCTATACGTTGCCTCG； 

引物2： 

S-P1：AAAAGCCCAAATTGCTGATG； 

S-P2：TGGCATGTTCATTGTCACCT； 

3、鉴定由木贼镰刀菌（F.equiseti）感染致木耳白毛菌病的PCR反应体系：25～100μl，含2.5～10μl10×PCR-Buffer，2.5～10μl dNTPs(500μM)，0.5～5.0μl Taq DNA聚合酶，0.1～5.0μl上游引物E-P1(0.6～3.0μM)，0.1～5.0μl下游引物E-P2(0.6～3.0μM)，模版0.1～10.0μl，其余用无菌水补齐。 

PCR反应流程：