[发明专利]一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法，特别是一种使用基因工程菌高效生产γ-氨基丁酸的方法。 

背景技术

γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric acid，简称GABA），由谷氨酸脱羧酶（Glutamate decarboxylase,简称GAD）催化谷氨酸（Glutamic acid，Glu）的α-脱羧反应生成，为哺乳动物中枢神经系统一种重要的抑制性神经递质，广泛存在自然界中，具有多种生理功能。目前已报道的生理功能包括调节血压与心率、辅助治疗哮喘、促使精神安定、增进脑活力、促进生长激素分泌、活化肝肾功能、促进乙醇代谢（醒酒）、改善更年期综合症等多种功效。鉴于GABA具有众多的生理功能，现在GABA已被作为一种新型功能因子广泛应用于食品、医药和农业等行业。 

目前工业上GABA作为一种安全级食品添加剂主要是通过植物富集和生物法合成获得。由于植物富集的含量很低，因此通过筛选安全级菌株，并利用其生物体内的谷氨酸脱羧酶作为催化剂来合成GABA具有获得高产的优势，在这个领域中目前很多工业生产集中于将筛选的乳酸菌进行一系列处理，GABA的产量可达130g/L。此外，利用基因工程技术过量表达谷氨酸脱羧酶基因，来进一步提高GABA的产量的研究已有相关报道。在这个研究领域中，主要是将这些来源于GABA积累菌株的谷氨酸脱羧酶基因导入到大肠杆菌或枯草芽孢杆菌的某个野生型菌株中，并使谷氨酸脱羧酶在宿主菌中得到高效表达，从而增强宿主菌生产GABA的能力。不管是乳酸菌发酵还是基因工程菌表达生产GABA，需要加入大量L-谷氨酸或L-谷氨酸钠作为前体物质，而L-谷氨酸或L-谷氨酸钠通常由谷氨酸棒杆菌发酵产生。因此，现有技术生产GABA的过程复杂且生产成本高。 

此外，之前研究过将短乳杆菌来源的谷氨酸脱羧酶基因导入到谷氨酸棒杆菌中构建基因工程菌pDXW8-gadB1/ATCC13032，经检测具有GABA合成能力，发酵60h结束后检测γ-氨基丁酸的含量为5.6mM（专利申请号201110020606.8；Shi F,Li YX(2011)Synthesis of gamma-aminobutyric acid by expressing Lactobacillus brevis-derived glutamate decarboxylase in the Corynebacterium glutamicum strain ATCC13032.Biotechnol Lett33:2469–2474），相对来说产量还是比较低。如何提高GABA的产量是一个重要的技术问题。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法，采用本研究组构建的大肠杆菌-棒状杆菌穿梭组成型表达载体pDXW-10（专利申请号200910260991.6）与短乳杆菌来源的谷氨酸脱羧酶基因gadB1、gadB2构建共表达重组质粒，导入到谷氨酸生产菌中构建基因工程菌，利用工程菌表达的谷氨酸脱羧酶将其自身积累的谷氨酸脱去一个羧基合成γ-氨基丁酸，通过发酵策略的优化获得较高GABA产量。 

具体方法如下：采用本实验室构建的大肠杆菌-棒状杆菌穿梭组成型表达载体pDXW-10（专利申请号200910260991.6），将从短乳杆菌Lactobacillus brevis Lb85（保藏编号：CCTCC NO：M2010367）上扩增出的目的基因gadB1、gadB2分别连接到载体上，构建出谷氨酸脱羧酶重组表达质粒pDXW10-gadB1、pDXW10-gadB2。然后将gadB2连同其前面的tac-M启动子序列一起扩增下来连接到已构建好的pDXW10-gadB1上，得到共表达重组质粒pDXW10-gadB1-gadB2。最后，将重组质粒pDXW10-gadB1-gadB2通过电转化的方法导入到谷氨酸棒杆菌ATCC13032中，得到重组谷氨酸棒杆菌pDXW10-gadB1-gadB2/ATCC13032，使得重组菌利用异源表达谷氨酸脱羧酶gadB1和gadB2将其自身积累的谷氨酸脱去一个羧基合成出γ-氨基丁酸。 

所述谷氨酸脱羧酶基因gadB1、gadB2的核苷酸序列分别NCBI公布的LVIS_1847和LVIS_0079所示。 

将上述谷氨酸棒杆菌工程菌在平板上活化36h，接入到种子培养基，带生长到对数生长期后，按照发酵起始浓度2.0接入发酵培养基，发酵起始6h-24h进行尿素间隔补加6次，发酵120h，收集发酵液测定γ-氨基丁酸产量达27g/L，谷氨酸的转化率达74%。