[发明专利]柳枝稷木质素合成酶F5H2基因序列

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学中的基因领域，具体地说，涉及柳枝稷木质素合成酶F5H2基因序列。

背景技术

柳枝稷是多年生禾本科、稷属、C4草本植物，起源于美国，作为纤维素乙醇转化的模式植物之一，具有适应性广泛、产量高、耐贫瘠、高光合利用率及高水氮利用率等优点。但其高木质素含量及复杂的结构限制了纤维素和半纤维素的水解，降低了糖化效率，增大纤维素转化乙醇的生产成本。拟解决的方法是利用生物技术手段，下调控制木质素合成的相关基因，减少木质素含量，改变木质素组成。

作为多年生草本植物，柳枝稷的木质素包含愈创木基木质素（G-木质素）、紫丁香木基木质素（S-木质素）对-羟基苯基木质素（H-木质素）。在这三种单体中S-木质素无游离的C-5，不能与其他单体交联从而结构相对疏松，有利于工业上的去木质作用。木质素生物合成研究表明，阿魏酸5-羟化酶(ferulate-5-hydroxylase)（简称F5H2）是S-木质素合成途径中的关键酶，过量表达F5H2基因能提高S-木质素含量，在总木质素含量不变的情况下，使G-木质素单体向S-木质素单体转化。研究表明，通过转基因改变作物的木质素性质，提高生物质的降解性，使细胞多糖更多地转化为可发酵多糖，从而提高柳枝稷的乙醇转化率，F5H2可以做为改变柳枝稷木质素性质、提高其细胞壁乙醇转化率的候选基因。

研究表明，控制G/S木质素单体相互转化的关键酶基因F5H家族的2个基因，分别命名为PvF5H1与PvF5H2，GenBank登录号分别为JQ430747与JQ430748。DNAMAN序列分析表明，这2个基因的核酸序列相似性为93%，氨基酸序列相似性为90%。（李园、王珊、方程；柳枝稷木质素合成酶基因F5H2核心片段的克隆与表达特性的分析[J]；草地学报；2012年05期）。

F5H2基因编码的蛋白相对不稳定，丰度低且与膜结合，所以研究起来比较困难。尽管如此，在许多双子叶植物中F5H2基因的cDNA或基因组DNA被克隆出来：拟南芥、构树、油菜、杨树、番茄、喜树等，单子叶植物中玉米、水稻、高粱等的F5H2基因也被部分或全部克隆出来。迄今为止，关于柳枝稷木质素单体生物合成的相关基因及其相应的酶的研究还很少。目前，在柳枝稷中只有4CL、CCR、CAD等基因被克隆出来，而F5H2基因的全长克隆研究还未见报道。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种柳枝稷木质素合成酶F5H2基因序列。

为了实现本发明目的，本发明首先提供了一种柳枝稷木质素合成酶F5H2基因，所述基因是下面（a）或（b）定义的多核苷酸：

（a）如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的多核苷酸；

（b）在严格条件下与SEQ ID No.1所示核苷酸序列的DNA杂交的多核苷酸。

所述基因表达得到的蛋白质的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了一种克隆前述基因的方法，所述方法包括如下步骤：

1）柳枝稷总RNA的提取与cDNA第一链的合成；

2）根据已知核心片断PvF5H2，GenBank登录号为JQ430748（如序列表SEQ ID No.3所示），使用Primer5.0设计基因特异性引物如下（引物设计原则见RACE试剂盒说明书）：

P0：5'-CTCCGAGGGCTTCATGCCGTCTGG-3'；

P1：5'-CGCCACCGTCTCCGTCCCGCCAAACAT-3'；

P2：5'-GGGTTCTTCCCCCGCCTGATGTGCT-3'；

P3：5'-AACTCCTCCTGGTCCTCGCCGTCGC-3'；

P4：5'-GGACTCGTCGCGCACCGCCACCCAC-3'；

3）通过3’RACE，利用引物P0克隆出F5H2基因的3’末端序列；

4）通过5’RACE，利用引物P1、P2、P3、P4克隆出F5H2基因的5’末端序列；

5）利用DNAMAN软件拼接F5H2基因的5’末端序列和3’末端序列，得到F5H2基因的全长cDNA序列；