[发明专利]一种酮还原酶突变体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及酮还原酶突变体及其制备方法，特别涉及一种源于酿酒酵母的酮还原酶突变体及其高效制备方法。

背景技术

阿托伐他汀钙（商品名LIPITOR由辉瑞公司销售）、罗苏伐他汀钙（商品名CRESTOR由阿斯利康公司销售）以及匹伐他汀（商标名Lipalo由Nissan Chemical及Kowa公司在日本销售），是重要的降胆固醇他汀类药物。而立体异构纯的顺式 3,5-二羟基己酸酯是这些重要的他汀类药物的关键的手性中间体。在已知的制备这些手性中间体的诸多途径中，包括化学法和酶法，都具有很多缺点。由于化学法合成过程条件苛刻，副反应多，产品分离纯化难度大，得率低，成本高，使其难以成为用于商品规模合成的理想方法。采用酶法制备立体异构纯的顺式 3,5-二羟基己酸酯需要使用具有立体选择性的酮还原酶，但现有的野生型酮还原酶催化活性很较低，使用10g/L粗酶粉 20小时仅可转化 1g/L的酮底物，也使其难以成为用于商品规模合成的理想方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种酶催化活性高的酮还原酶及其制备方法。

实现本发明目的的技术方案是：酿酒酵母(Saccharomces cerevisiae)中天然存在的野生型酮还原酶，能够使5-羟基-3-氧代己酸酯转化为对应的顺式3,5-二羟基己酸酯。本公开内容的发明人已发现包括在一定位置突变的酮还原酶与酿酒酵母(Saccharomces cerevisiae)产生的野生型酮还原酶 (SEQ ID NO：2)相比表现出增加的催化活性。“野生型酮还原酶”、“野生型KRED酶”及“野生型 KRED酮还原酶”指由源自酿酒酵母(Saccharomces cerevisiae)的野生型酮还原酶基因SEQ ID NO：1编码的，并具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的酮还原酶。该酶能立体选择地还原5-羟基-3-氧代己酸酯的3-氧代基因以产生对应的顺式3,5-二羟基己酸酯。“野生型”指与自然中所发现的一样的材料或物质的形式。例如野生型的蛋白质或核酸序列是可以从自然界中的分离并且未经过人为修饰的，在生物体中存在的原始序列形式。“增加的催化活性”指在体外或体内试验中所测量的与野生型酮还原酶相比，表现出使底物 (例如5-羟基-3-氧代己酸酯)向产物 (例如顺式3,5-二羟基己酸酯 )转化率增加的酮还原酶。

本发明提供一种酮还原酶突变体，其源于酿酒酵母(Saccharomces cerevisiae)的野生型酮还原酶，能够立体选择地还原5-羟基-3-氧代己酸酯的3-氧代基因以产生对应的顺式3,5-二羟基己酸酯。所述酮还原酶突变体，与SEQ ID NO.2的野生型酮还原酶相比表现出更强的催化活性。酮还原酶突变体和编码这种突变体的多核苷酸可以使用本领域技术人员通常使用的方法制备。突变体可以通过使编码该酶的体外重组、多核苷酸诱变、DNA改组、易错PCR和定向进化方法等获得。

上述酮还原酶突变体，具有选自以下特征中的一个或多个突变： I46V， S127N，Q144K。

上述酮还原酶突变体，优先自序列SEQ ID NO.4。全长突变的酮还原酶对于保持酶的催化活性并不是必需的。相应地，应考虑酮还原酶突变体的截短的类似物和有催化活性的片段。例如，在一些实施方案中，C端或N端的数个氨基酸可以被删去。任何特定的截短的类似物或片段可以利用相应的试验来评估催化活性。同样的，额外的氨基酸残基可以被添加到一个或两个末端而不影响催化活性。额外序列可以是功能性的或非功能性的。例如，额外氨基酸序列可以被用来帮助纯化，做为标记，或执行一些其它的功能。因此，本公开内容的酮还原酶突变体可以是融合蛋白的形式，其中酮还原酶突变体(或其片段 )诸如通过助溶标签 (如SUMO蛋白 )、纯化标签 (如结合金属的 His标签 )和细菌定位信号 (如分泌信号 )的实例而非限制的方式被融合到其它蛋白质。

本发明提供一种酮还原酶突变体，其酮还原酶活性比野生型酮还原酶的活性至少增强2-100倍。

上述酮还原酶酶基因突变体，其优选自SEQ ID NO.3，其已经过序列优化以适于在大肠杆菌中表达。在一些实施方案中，多核苷酸包括被优化用于在特定类型的宿主细胞中表达的密码子。用于各种不同类型的微生物的密码子的使用和偏好性是已知的，因为其是用于在这些微生物的表达特定的氨基酸的优化的密码子。