[发明专利]一种大肠杆菌O1、O2、O18、O78血清型检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种大肠杆菌O1、O2、O18、O78血清型检测试剂盒及其检测方法。 

背景技术

大肠杆菌是大肠埃希氏菌（Escherichia coli,E.coli）的俗称，属于肠杆菌科（Enterobacteriaceae）、埃希氏菌属（Escherichia）的成员，由德国细菌学家Theodor Escherich于1885年首次从婴儿粪便中分离，由此得名大肠埃希氏菌。自然界中大肠杆菌种类很多，其中绝大多数非致病性大肠杆菌是人类和动物肠道内的正常菌群的主要成员，对肠道正常生理功能的维持具有积极意义。但某些特殊血清型具有致病性，可以引起人或动物的腹泻、泌尿道感染、肺炎、败血症、心内膜炎、幼儿脑炎，家禽的卵黄性腹膜炎、肉芽肿等病症(Kaper J B,Nataro J P,Mobley H L.Pathogenic Escherichia coli.Nat Rev Microbiol,2004,2(2):123-140)。 

大肠杆菌抗原复杂，主要有菌体抗原（O）、荚膜抗原（K）、鞭毛抗原（H）和菌毛抗原（F）等，是血清型鉴定的物质基础。目前已知大肠杆菌O抗原有176种，是光滑型（S型）细菌溶解后释放出的内毒素，化学成分为多糖-磷脂复合物，S型细菌丢失O抗原即变成R型菌，此菌株无法做分型鉴定。K抗原是热不稳定抗原，多存在于荚膜或类似结构中，个别位于菌毛中，目前确定有103种K抗原。具有K抗原的菌株不会被其相应的抗O血清凝集，称为O不凝集性。K抗原有抗吞噬和补体杀菌作用，与细菌的毒力有关。根据耐热性等不同，K抗原分为L、A、B三种，其中L、B不耐热。H抗原是一类不耐热的鞭毛蛋白抗原，有83种，与细菌致病力关系不大。F抗原至少有5种，如F1、F4（K88）、F5（K99）、F18、F41等，F抗原与大肠杆菌的黏附作用有关（陆承平主编,兽医微生物学,第四版,中国农业出版社,2007,100-102）。 

目前，根据对大肠杆菌抗原的鉴定，可用O:K:H排列表示其血清型，其中O抗原又作为大肠杆菌最为常用的分型抗原。每个大肠杆菌菌株仅含有一种O抗原，可用单因子抗O血清做玻板或试管凝集试验鉴定（陆承平主编,兽医微生物学,第四版,中国农业出版社,2007,100-102）。然而，血清凝集试验存在诸多不足，如交叉反应多，敏感性低。因此，实现大肠杆菌血清型的快速有效检测，对于大肠杆菌鉴定具有重要的作用。 

基于聚合酶链反应（PCR）扩增的基因诊断技术备受青睐，聚合酶链反应对象是针对特定模板DNA基因片段设计的一小段互补寡核苷酸，PCR技术模拟DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物，该原理主要包括3个基本反应过程:变性-退火-延伸。变性主要是指双链DNA的变性，即双链DNA经加热后，其热稳定性降低，配对碱基之间的氢键断裂，使双链DNA成为单链，以便与引物结合。退火是指单链DNA在温度降低时与引物的复性（称为退火）。在此过程中，引物与单链DNA模板仍然按照碱基互补的方式配对。延伸是指引物与DNA模板按碱基互补的原则配对后，在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，进行体外的半保留复制，合成一条新的与模板DNA链互补的新链。经重复循环变性-退火-延伸3个过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。通过倍数级的扩增后，该反应体系中表达出大量的规定长度目的基因片段。PCR产物通过凝胶电泳试验来验证是否含有要求长度的基因。通过PCR反应，能够在短时间内确定待检模板是否为目的产物。