[发明专利]一种大肠杆菌O1、O2、O18、O78血清型检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种用于检测大肠杆菌O1、O2、O18、O78血清型的引物组，其特征在于，包括以下引物，其核苷酸序列分别为：

ECO-F：5’-CGATGTTGAGCGCAAGGTTG-3’(SEQ ID NO.1)

O1-R：5’-CATTAGGTGTCTCTGGCACG-3’(SEQ ID NO.2)

O2-R：5’-GATAAGGAATGCACATCGCC-3’(SEQ ID NO.3)

O18-R：5’-AGAAGCATTGAGCTGTGGAC-3’(SEQ ID NO.4)

O78-R：5’-TAGGTATTCCTGTTGCGGAG-3’(SEQ ID NO.5)；

正向引物ECO-F为高度保守的大肠杆菌O抗原合成相关基因序列，反向引物O1-R、O2-R、O18-R、O78-R分别为O1、O2、O18、O78血清型大肠杆菌O抗原合成相关基因的血清型特异性序列。

2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，大肠杆菌O1、O2、O18、O78血清型特异性引物扩增的目的片段大小分别为：263bp、355bp、459bp和623bp。

3.权利要求1或2所述引物组在制备检测大肠杆菌O1、O2、O18、O78血清型试剂盒中的应用。

4.一种含权利要求1或2所述引物组的大肠杆菌O1、O2、O18、O78血清型检测试剂盒。

5.根据权利要求4所述的大肠杆菌O1、O2、O18、O78血清型检测试剂盒，其特征在于，其还含有10×Taq Buffer、Taq DNA聚合酶、MgCl₂及dNTP。

6.根据权利要求5所述的大肠杆菌O1、O2、O18、O78血清型检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：10×Taq Buffer2.5μL、Taq DNA聚合酶（2.5U/μL）1.0μL、MgCl₂（25mM）2.0μL、dNTPs混合溶液（每种为2.5mM）4.0μL、引物ECO-F和O1-R、O2-R、O18-R、O78-R各0.5μL。

7.一种检测大肠杆菌O1、O2、O18、O78血清型的方法，其特征在于，先将待测大肠杆菌菌液或待测大肠杆菌的DNA提取物作为模板，用权利要求1或2所述的正向引物ECO-F和反向引物O1-R、O2-R、O18-R、O78-R作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行检测，若电泳结果出现263bp条带为大肠杆菌O1血清型；出现355bp条带为大肠杆菌O2血清型；出现459bp条带为大肠杆菌O18血清型；出现623bp条带为大肠杆菌O78血清型。

8.根据权利要求7所述试剂盒在用于检测大肠杆菌O1、O2、O18、O78血清型的方法，其特征在于，PCR反应体系为25μL时含有：10×Taq Buffer2.5μL、Taq DNA聚合酶（2.5U/μL）1.0μL、MgCl₂（25mM）2.0μL、dNTPs混合溶液（每种为2.5mM）4.0μL、引物ECO-F和O1-R、O2-R、O18-R、O78-R各0.5μL、模板1.0μL、超纯水12.0μL。

9.根据权利要求7或8所述试剂盒在用于检测大肠杆菌O1、O2、O18、O78血清型的方法，其特征在于，PCR反应参数：95℃预变性5min；95℃40s，55℃40s，72℃1min，30个循环；72℃10min。

10.根据权利要求7所述试剂盒在用于检测大肠杆菌O1、O2、O18、O78血清型的方法，其特征在于，包括下列步骤：

1）大肠杆菌模板的制备

将大肠杆菌菌株接种至LB液体培养基，37℃摇菌，至OD600=1.0，取1mL菌液12000r/min离心1min，去上清，灭菌超纯水洗3次，1mL灭菌超纯水重悬，制成模板备用；

2）特异性引物的制备

权利要求1所述的引物ECO-F和O1-R、O2-R、O18-R、O78-R的使用浓度为10pM；引物稀释液置于-20℃保存备用，避免反复冻融；

3）PCR反应体系的建立和扩增

取PCR管，分别加10×Taq Buffer2.5μL、Taq DNA聚合酶（2.5U/μL）1.0μL、MgCl₂（25mM）2.0μL、dNTPs混合溶液（每种为2.5mM）4.0μL、引物ECO-F和O1-R、O2-R、O18-R、O78-R各0.5μL、模板1.0μL、超纯水12.0μL，混匀；PCR反应参数：95℃预变性5min；95℃40s，55℃40s，72℃1min，30个循环；72℃10min；

4）PCR检测结果判定与表述

取10μL PCR产物，点样于2.0%琼脂糖凝胶电泳板孔中，100V电压，电泳40min，于凝胶成像系统下拍照判定，判定前提条件为阴性对照无任何条带出现，具体判定方法：电泳结果出现263bp条带为大肠杆菌O1血清型；出现355bp条带为大肠杆菌O2血清型；出现459bp条带为大肠杆菌O18血清型；出现623bp条带为大肠杆菌O78血清型。