[发明专利]多肽微阵列芯片在血浆中检测凝血酶活性及筛选凝血酶抑制剂的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种多肽微阵列芯片在血浆中检测凝血酶活性及筛选凝血酶抑制剂的方法，属于多肽微阵列芯片技术领域。

背景技术

凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶，在凝血途径中它一方面将纤维蛋白原转化为纤维蛋白，促进血小板聚集，加速血液凝固，另一方面又激活抗凝机制，防止血栓形成。凝血酶的形成是整个凝血途径中各因子相互作用的结果，低水平的凝血酶活性与出血有关，高水平的凝血酶活性与血栓前状态相关(Thrombin Functions During Tissue Factor-Induced Blood CoaguLation,Blood,2002,100,148-152；ABriefHistoricalReviewoftheWaterfall/CascadeofBloodCoaguLation,J.Biol.Chem.,2003,278,50819-50832)。

血液凝结是一个受多种因子调控的复杂网络过程，某一因子浓度的改变都会改变体系中其他因子的浓度。凝血酶活性检测能更准确地反映凝血途径中各因子的组合效应(In Vivo Imaging of Thrombin Activity in Experimental Thrombi with Thrombin-Sensitive Near-Infrared MolecuLar Probe,Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.,2002,22,1929-1935)。现有分析化学技术中检测血浆中的凝血酶多采用加标实验，引入的凝血酶会改变体系中其他因子的浓度，从而导致凝血酶本身的浓度也发生改变，所以分析化学技术中凝血酶的检测不适用于血液凝结环境。

多肽微阵列芯片技术是一种广泛用于研究抗原表位分析，蛋白与底物的相互作用，细胞内含物与多肽的相互作用，以及小分子物质与蛋白的相互作用的高通量分析方法(Microarray-Based Detection of Protein Binding and Functionality by Gold Nanoparticle Probes，Anal.Chem.,2005,77,5770-5774)。但现有技术中，还没有利用多肽微阵列芯片在血浆中检测凝血酶活性和筛选凝血酶抑制剂的方法。

发明内容

为解决现有分析化学中检测凝血酶的方法不适用于血液凝结环境中凝血酶的检测及凝血酶抑制剂的筛选的技术问题，本发明提供一种多肽微阵列芯片在血浆中检测凝血酶活性及筛选凝血酶抑制剂的方法。

本发明的多肽微阵列芯片在血浆中检测凝血酶活性的方法，包括以下步骤：

(1)将多肽微阵列芯片与激活的血浆在36-38°C反应40min以上，得到反应后的多肽微阵列芯片；

所述多肽微阵列芯片以生物素修饰的多肽为底物，所述多肽的氨基酸序列为Cys-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-Arg-Gly-Pro-Arg-Val-Val-Lys，Cys-Glu-Gly-Phe-Phe-Ser-Ala-Arg-Gly-His-Arg-Pro-Leu-Lys，Cys-Ala-Glu-Gly-Gly-Val-Pro-Arg-Ser-Phe-Arg-Val-Val-Lys，Cys-Ala-Glu-Gly-Gly-Phe-Pro-Arg-Ser-Phe-Arg-Val-Val-Lys，Cys-Ala-Glu-Gly-Gly-Val-Pro-Arg-Ser-Phe-Lys-Val-Val-Lys，Cys-Gly-Gly-Gly-Ala-Arg-Pro-Arg-Ser-Leu-Leu-Val-Gly-Lys，Cys-Ala-Glu-Gly-Gly-D-Phe-Pro-Arg-Ser-Phe-Arg-Val-Val-Lys或者Cys-Gly-Gly-Gly-Val-Arg-Pro-Gly-Arg-Val-Gly-Gly-Gly-Glu-Ala-Leu-Phe-Asp-Lys，其中，生物素均修饰在末端赖氨酸上，D-Phe为D型苯丙氨酸，其它氨基酸均为L型氨基酸；

(2)将反应后的多肽微阵列芯片与亲和素(avidin)反应1h以上，再与多肽修饰的金纳米粒子反应1h以上，得到金纳米粒子标记的多肽微阵列芯片；

所述多肽修饰的金纳米粒子为Cys-Ala-Leu-Asn-Asn与Cys-Ala-Leu-Asn-Asn-Gly-Lys-Gly修饰的金纳米粒子，其中，Lys上修饰有生物素；

(3)检测金纳米粒子标记的多肽微阵列芯片上金纳米粒子的共振光散射信号，实现对凝血酶活性的检测。