[发明专利]二种食源性致病菌多重快速检测法及检测引物组和试剂盒

说明书

技术领域

本发明属食品微生物分子生物学检测领域，涉及一种沙门氏菌和金黄色葡萄球菌多重快速检测方法及其检测引物组和检测试剂盒。

背景技术

食品安全是世界各国关注的重大问题，而其中食源性致病菌是影响食品安全的主要原因之一。根据现行国家食品安全监管体系，沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均属重点关注的食源性致病菌。常规检测采用传统培养方法，且每个致病菌需应用独立的检测方法单独进行检测，工作量大，检测周期长，且受到检测人员专业、经验等多种因素限制，容易出现误判。随着分子生物学方法在食品微生物检测中的逐步应用，致病菌的检测效率也逐步提升。

LAMP方法是一种新型的恒温核酸扩增技术，该技术主要利用4种不同的特异性引物识别靶DNA上6个特定区域，并利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶（BstDNA），在恒温条件下快速扩增核酸，保证了扩增的高特异性和高效率。为进一步缩短反应时间，可以额外增加1至2条环引物以提高扩增效率。鉴于LAMP技术有众多优势，现已被逐渐应用于病原微生物的检测。如分支杆菌属、阪崎肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等。

目前已有的LAMP检测方法通常只能在一个系统中针对单一一种致病菌进行检测，在需要快速筛查多个致病菌时，需分别对其进行检测，仍有较大工作量。多重恒温核酸检测技术能在同一反应体系中，同一反应条件下，实现多个目的菌的快速筛查。另外，由于LAMP扩增产物在普通电泳呈现梯状条带，因此多重LAMP产物无法通过普通电泳区别分子量来实现对目标产物的识别，而在以往的报道中往往采用较为繁琐的酶切或者测序的方式对扩增产物进行鉴别，对扩增产物的分析和鉴别仍有待提高。

熔解曲线（Dissociation curve）是随温度升高DNA的双螺旋结构降解程度的曲线。总的DNA双螺旋结构降解一半的温度称为融解（Tm），不同序列的DNA，Tm值不同。因此熔解曲线分析可以用来确定不同的反应产物。扩增反应完成后，通过逐渐增加温度同时监测每一步的荧光信号来产生熔解曲线，随着反应中双链DNA变性，荧光染料又回复到游离状态导致荧光信号降低，用荧光信号改变的负的一次导数与温度作图，在扩增产物的熔解温度上有一特征峰（Tm，DNA双链解链50％的温度），用这个特征峰就可以将不同扩增产物区分开，因为它们的熔解温度不同，故可用于对多重LAMP产物的分析。而作为熔解曲线分析一般使用Eva Green或LC Green这类非特异性饱和荧光染料。

发明内容

本发明的目的是提供一种二种食源性致病菌多重快速检测法及检测引物组和试剂盒，可以在一个系统中针对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌进行检测，以确定样品中是否含有沙门氏菌和金黄色葡萄球菌中的一种或二种。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明沙门氏菌的快速检测引物组中，其外引物的上游引物的序列如SEQ No.1所示，其外引物的下游引物的序列如SEQ No.2所示；其内引物的上游引物的序列如SEQ No.3所示，其内引物的下游引物的序列如SEQ No.4所示。

本发明金黄色葡萄球菌的快速检测引物组中，其外引物的上游引物的序列如SEQ No.5所示，其外引物的下游引物的序列如SEQ No.6所示；其内引物的上游引物的序列如SEQ No.7所示，其内引物的下游引物的序列如SEQ No.8所示；其环引物的序列如SEQ No.9所示。

使用本发明检测引物组对食品中的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌进行多重快速检测的方法是：将沙门氏菌的检测引物组和金黄色葡萄球菌的检测引物组的检测引物组与待测样品的DNA进行LAMP反应，在反应结束后对反应液进行分析，以确定所述样品中是否含有沙门氏菌和/或金黄色葡萄球菌；在所述沙门氏菌的检测引物组中，外引物的上游引物的序列如SEQ No.1所示，外引物的下游引物的序列如SEQ No.2所示，内引物的上游引物的序列如SEQ No.3所示，内引物的下游引物的序列如SEQ No.4所示；在所述金黄色葡萄球菌的检测引物组中，外引物的上游引物的序列如SEQ No.5所示，外引物的下游引物的序列如SEQ No.6所示，内引物的上游引物的序列如SEQ No.7所示，内引物的下游引物的序列如SEQ No.8所示，环引物的序列如SEQ No.9所示。在本发明中，待测样品为食品，例如乳制品、肉制品、饮用水等。

进一步地，本发明所述LAMP反应的反应温度为61.5-64.5℃，反应时间为60-80min。

进一步地，本发明所述“对反应液进行分析”的方法为：对所述反应液进行DNA熔解曲线分析，其中，熔解曲线的温度区间为63-95℃。