[发明专利]一种铜绿微囊藻的快速计数方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种藻类监测计数的方法，具体涉及一种铜绿微囊藻的快速计数方法。

背景技术

水体富营养化导致藻类大量繁殖形成水华，蓝藻水华最为常见，其中蓝藻属的铜绿微囊藻是形成水华最主要的藻类，并且它经常产生微囊藻毒素，严重威胁到其他水生生物甚至是人类的健康，所以铜绿微囊藻也是蓝藻中危害最大的藻类。为了有效防控蓝藻水华，对铜绿微囊藻的监控显得尤为重要。

通常，反映藻类生物量的方法有细胞计数法和叶绿素a含量测定法。细胞计数法可以采用传统的镜检法和流式细胞仪计数。镜检法需要连续观察多个视野，不仅效率低，而且由于容易漏数、重复计数，准确度不高。流式细胞仪计数虽然准确快速，但是仪器价格昂贵，不可普遍使用。目前最常用的浮游植物叶绿素a的测定方法是分光光度计法，但是这种方法分析操作步骤繁琐，一般无法用于大量样品的测定。并且，该方法需要用有机溶剂（丙酮、甲醇和乙醇等）对色素进行萃取，因此对操作人员有一定的毒害作用。

针对我国藻类监测计数手段匮乏和效率低的现状，建立一种简易、准确的铜绿微囊藻计数方法对有害藻类的监测有重要意义。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中藻类生物量监测计数方法的不足，提供一种更简单、方便、有效的铜绿微囊藻的快速计数方法，测定藻类生物量。

本发明采用以下技术方案：

一种铜绿微囊藻的快速计数方法，其特征在于：将含铜绿微囊藻的待测样品稀释一定倍数后，采用酶标仪测定藻液在波长680nm处的吸光度，根据建立的吸光度和细胞密度之间的校正曲线或回归方程，计算得到待测样品中的铜绿微囊藻的数量。

所述的方法包括以下步骤：

1）校正曲线或回归方程的建立

配制一组含铜绿微囊藻的不同浓度的藻液，通过酶标仪测定不同浓度藻液在波长680nm处的吸光度A_i，同时用显微镜对每个浓度的藻液中铜绿微囊藻的细胞精确计数，得到细胞密度C_i，即单位体积藻液中铜绿微囊藻的细胞数；测定空白样品在波长680nm处的吸光度A₀，根据吸光度A_i-A₀和细胞密度C_i绘制校正曲线，或线性回归计算得到线性回归方程；

2）铜绿微囊藻计数

将含铜绿微囊藻的待测样品稀释一定倍数，使稀释后的藻液其细胞密度在校正曲线或回归方程的线性范围内，在与步骤1）相同的条件下，采用酶标仪测定稀释后藻液在波长680nm处的吸光度，根据校正曲线或回归方程计算得到待测样品中的铜绿微囊藻的个数。

本发明方法直接测定待测样品的吸光度值，根据吸光度和铜绿微囊藻细胞密度之间的关系对其快速计数。与传统的镜检计数法相比，其操作更为简单，相同时间内测定的样品数量有显著提高，同时因为排除了人为可能造成的漏数、重复计数，因而准确性更高；与叶绿素a含量测定法相比，虽然同样采用分光光度法，本发明方法无需对样品进行预处理，其操作简易、环保、效率高。

铜绿微囊藻内色素含量与特定吸收波长的峰高相关，测定藻液的紫外可见光吸收光谱可知铜绿微囊藻在680nm处具有最大吸收峰。而且以680nm为测量波长，铜绿微囊藻的细胞数与吸光度相关性较好。

所述的铜绿微囊藻快速计数方法中，校正曲线或回归方程的建立按如下步骤进行：

取1ml灭菌培养基培养的对数期的铜绿微囊藻，分别稀释2、5、8、10、20、50、100、1000倍，空白组加入灭菌的培养基，将稀释后不同浓度的藻液和空白组加入微孔板中，每组5～10个平行样；通过酶标仪测定每个浓度藻液在波长680nm处的吸光度，取平均值得到该浓度藻液的吸光度A_i，空白样品的吸光度A₀；同时用显微镜对每个浓度的细胞精确计数，每个样品重复5-8次，取平均值得到细胞密度C_i，在吸光度A_i-A₀和细胞密度C_i之间建立校正曲线或回归方程。

所述的铜绿微囊藻的培养基为灭菌的BG-11。

所述方法中，含铜绿微囊藻的待测样品稀释后的藻液取8-10个平行样，加入微孔板中，采用酶标仪测定波长680nm处的吸光度，取平均值。

所述方法中，所用微孔板通常可选用96孔板，每孔300μl样品。

根据本发明的方法，藻液吸光度和细胞密度之间呈线性关系，两者相关系数显著。根据得到的校正曲线或回归方程可以对待测样品中的铜绿微囊藻进行定量。