[发明专利]硫磺素T染色对β-淀粉样蛋白病理的分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种用硫磺素T染色对β-淀粉样蛋白病的病理诊断方法。属于应用硫磺素T(ThT)标记β淀粉样蛋白开展对阿尔茨海默病(AD)和淀粉样脑血管病患者的脑组织病理标本和脑组织病理学特异性诊断的技术领域。

背景技术

对AD的病理学诊断研究常依赖于传统的银染色法，既繁琐且技术要求较高；80年代开始的Aβ免疫组化检测由于多种抗体识别率不同，对抗体的特异性要求较高，且操作步骤相对繁琐，一定程度上限制了其应用；一直到2011年美国国立老年研究所-阿尔茨海默病协会(NIA-AA)修订了AD的病理学诊断标准才有推荐的特异性Aβ抗体诊断，但是仍存在费用高昂，耗时长，检测效果不稳定等问题。

发明内容

本发明提出的是用一种硫磺素T染色对β-淀粉样蛋白病的特异性病理诊断方法，其目的旨在揭示硫磺素T可以特异性标记β淀粉样蛋白，并直观反映病因治疗的效果：硫磺素T特异性标记脑出血患者的手术病理标本中淀粉样血管病变，直接确诊脑出血患者的病因学。

本发明的技术解决方案：硫磺素T染色对β-淀粉样蛋白病理的分析方法，包括如下工艺，

A 患者病理标本来源，手术治疗患者的脑组织病理标本；

B 实验动物病理标本来源，12月龄阿尔茨海默病转基因模型动物，该动物麻醉处死后，灌注取脑；

C患者及实验动物脑组织标本的处理，针对患者及实验动物脑组织标本，取材时间为2h以内；用锋利的刀刃取材，组织的标本厚度不超过0.2cm，并及时放入质量浓度为10%中性缓冲甲醛液中固定；在石蜡切片时厚度应为3~5μm，并应尽量切薄；

D 标本β淀粉样蛋白1-42免疫组化染色，切片经二甲苯脱蜡、水化，将水化的组织切片置于立式染色缸(5片/缸)中，并向染色缸中加入抗原修复液，浓度为0.01M柠檬酸缓冲液，将立式染色缸置于高压锅内，该高压锅内蒸汽压力为1.6公斤/cm2，电磁炉加热（2000℃），以喷气记时2~3min，停止加热，自行冷却，减压后持续20min，将立式染色缸移出高压锅，流水冲洗将修复液洗尽，放入蒸馏水中，质量浓度为0.3%H₂O₂作用5~10min，将组织切片置于蒸馏水中，PBS液冲洗三次，每次3~5min，加入兔抗鼠β淀粉样蛋白1-42抗体1：600，切片放入湿盒内，该湿盒放在4℃冰箱内过夜，取出湿盒，PBS冲洗三次，每次3~5min；加HRP羊抗兔IgG 1：5000，将湿盒设在37℃内孵育30min，PBS冲洗三次，每次3~5min；DAB显色，镜下观察，控制显色时间，有阳性表达将终止显色，自来水洗；苏木素染色1~2min，自来水洗，质量浓度为1%盐酸乙醇分化，质量浓度为5%的碳酸氢钠或温水返蓝，脱水、透明、中性树胶封固；

E 标本硫磺素T染色，切片脱蜡、水化；组织切片入苏木素染液染色5min，自来水洗后入蒸馏水；将组织切片置入质量浓度为1%硫磺素T染液浸染5~10min，迅速蒸馏水洗，用中性甘油封固；避光保存；所述的苏木素染液是由苏木素2.5g，无水酒精25ml,硫酸铝钾，50g,蒸馏水500ml，黄色氧化汞1.25g，冰醋酸 20ml配制而成；

F 光学/荧光显微镜病理检查，免疫组化染色切片在光学显微镜下以10×，40×放大倍数观察，计数阳性染色并拍照，硫磺素T染色切片在荧光显微镜下以10×，40×放大倍数经488nm光源激发，观察、计数阳性染色并拍照；阳性细胞计数：每个脑组织选4张连续切片，在10×光镜下随机选择不重叠的5个视野，计数阳性着色细胞，然后进行组间比较。

本发明的优点：引进并广泛应用硫磺素T标记淀粉样蛋白病患者脑组织病理标本和评估阿尔茨海默病(AD)转基因动物的药物干预效果，与传统的银染法、Aβ免疫组化方法相比，具有简便易行，敏感可靠的特点。而且有助于明确脑出血的病因学，这对于患者二级干预措施的制订极具指导价值。该技术的广泛应用将对Aβ相关疾病（阿尔茨海默病、淀粉样血管病）的临床病理学研究和转化医学研究起到有力的推动作用。

具体实施方式

实施例，

取患者病理标本，

2010-2012年期间因脑出血在南京医科大学附属脑科医院神经外科接受手术治疗患者的脑组织病理标本46例。

取实验动物病理标本，

12月龄阿尔茨海默病转基因模型动物(APPswe/PS1dE9双转基因鼠)购买自中国医学科学院实验动物研究所，动物麻醉处死后，灌注取脑。