[发明专利]乙型肝炎病毒P区变异及其用途

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域；具体地说，本发明涉及乙型肝炎病毒P区变异；基于这些变异情况，本发明提供了可用于肝癌预测以及早期(辅助性)诊断的检测试剂或试剂盒。 

背景技术

原发性肝细胞肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，已占居民肿瘤死亡的第二位。乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染是导致我国肝癌发生的首要原因。我国约有HBV表面抗原(HBsAg)携带者1.2亿，他们中相当部分的慢性肝炎患者，经10～20年的发展会进入肝硬化状态，而肝硬化患者中每十年即有30～50%的人将演变成肝癌。近年来，随着乙肝疫苗的普遍应用，我国儿童中肝炎的发病得到了很好的控制。但在那些已经感染了乙肝病毒的人群中，肝癌的发病率和死亡率却仍然呈上升趋势。 

乙型肝炎病毒属于嗜肝性DNA病毒科，其基因组为部分环状双链DNA，约3200bp，由正链和负链构成(图1)。负链含有4个开放读码框(Open Reading Frame，ORF)：前S/S区、X区、P区(聚合酶)以及P区(precore/core，pre-C/C)；除此之外还有多个基因表达调控序列，包括2个直接重复序列(DRI、DRII)、2个增强子(ENI、ENII)和4个启动子(SP1、SP2、XP和CP)。HBV前S/S区包括前S1基因、前S2基因和S基因，分别编码病毒包膜大蛋白(400aa)、中蛋白(271aa)和小蛋白(226aa)；X区编码HBV X蛋白；HBV的前C基因及C基因则共享另一个开放读码框P区，根据不同的起始密码子，分别编码病毒核心抗原(Hepatitis B Core Antigen，HBcAg)和e抗原(Hepatitis B e Antigen，HBeAg)，P区编码DNA聚合酶。 

P基因是最长的开放读框，与C、S与X基因重叠，具体的碱基相对位置见图2。P基因主要编码HBV聚合酶。HBV聚合酶是乙肝病毒复制的物质基础。根据功能的不同，HBV聚合酶从氨基端开始分为四个区，分别为末端蛋白区(TP)、间隔区(SD)、逆转录酶区(RT)和RNase H区。其中逆转录酶RT区是HBVDNA聚合酶的主要功能区，同时具有反转录酶及DNA聚合酶活性，作用是将 前基因组RNA反转录成负链HBV DNA，并以此负链DNA为模板合成正链DNA。HBV的逆转录酶区可进一步分为五个主要的功能域，A区(421～436氨基酸)、B区(506～528氨基酸)、C区(546～550氨基酸)、D区(576～589氨基酸)及E区(592～600氨基酸)。这五个区域的氨基酸高度保守，为维持反转录酶活性所必须，其中A、C、D区为聚合酶与三磷酸核苷结合的结合域，B、E区为RNA模板和引物定位域。目前临床应用的拟核苷类药物主要的靶位点位于逆转录酶RT区的B及C区，HBV多聚酶的催化域即位于C区的YMDD基序。也是拉米夫定等抗病毒药物治疗时HBV最常出现变异的区域。P基因变异主要见于POL/RT基因片段(349～692aa，即rt1～rt344)。在拉米夫定的抗病毒治疗中，最常见的是酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸(YMDD)变异，即由YMDD变异为YIDD(rtM204I)或YVDD(rtM204V)，并常伴有rtL180M变异，且受药物选择而逐渐成为对拉米夫定耐药的优势株。较早的研究报道，多为P基因与拉米夫定等核苷酸耐药有关系，P基因与肝癌的发生关系至今仍很少报道。 

目前常用的基因突变检测方法包括限制性片段长度多态性(RFLP)，单链构象多态性(PCR-SSCP)，基因芯片及DNA序列测定技术。PCR-SSCP用于检测基因突变操作繁琐、检测通量低，而且不能判断特异性位点的突变形式。而RFLP是使用核酸内切酶对扩增后的靶序列特异性位点的切割，然后通过电泳检测判断不同的基因型，但是由于HBV基因组分子进化速度较快、变异频繁，因此结果分析准确率较低。近年来，基因芯片技术已成功应用于核酸分析，对检测HBV基因组多态性具有很大的优势，但因其检测费用昂贵而限制了该技术在临床实验室的推广和应用。因此，本领域有必要开发优化的且切实可推广应用的临床检测技术。 

发明内容

本发明的目的在于提供乙型肝炎病毒P区变异及其用途。 

本发明的目的还在于提供用于肝癌预测以及早期(辅助性)诊断的检测试剂或试剂盒。 

在本发明的第一方面，提供一种检测核酸样品中是否存在乙型肝炎病毒P区变异的试剂盒，它包括： 

扩增含有乙型肝炎病毒P区第1055位碱基序列的引物；和/或 

与乙型肝炎病毒P区第1055位为碱基“A”的序列结合的探针。